橋本甲狀腺炎相關miRNAs研究進展

魏軍平 趙 靜 孫士鵬 柏力萄 李 菲

作者單位：100053 北京，中國中醫科學院廣安門醫院內分泌科(魏軍平、趙靜、柏力萄、李菲)，檢驗科(孫士鵬)

橋本甲狀腺炎(hashimoto thyroiditis，HT)又稱慢性淋巴細胞性甲狀腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis)，是自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)的常見類型，以甲狀腺組織中廣泛淋巴細胞和漿細胞浸潤為病理特征[1]。近年來，HT在世界范圍內的發生率顯著增加，已達1%～2%，其中男、女性別比例約為(1∶5)～(1∶10)[2]。盡管目前HT在發病機制、診斷及治療方面取得了一定進展，但具體發病機制仍未完全闡明，治療手段缺乏針對病因的治療，而以隨訪、甲狀腺功能減退期甲狀腺激素的補充等為主。miRNAs是一類非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平調節mRNA的表達，從而在細胞增殖、分化、凋亡、機體應激、免疫、生長和發育等多種生物學進程中發揮重要調控作用。研究表明，miRNAs的異常表達與HT的發生、發展和預后均有密切關系，有望作為特異性生物標志物及治療靶標應用于臨床。

一、 miRNAs概述

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平調節mRNA的表達。miRNAs普遍存在于動、植物中，可調節人類約20%～30%的mRNA。自1993年發現首個miRNA(lin-4)以來，多種miRNAs在不同生物中被大量發現，成為當今科學研究的熱點。miRNAs的生物發生及成熟在蛋白質和酶的幫助下相繼發生在細胞核與細胞質中。miRNAs可靶向編碼蛋白質轉錄物的mRNA序列，通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負向調控靶基因，進而參與調節細胞增殖、分化、凋亡、機體應激、免疫、生長和發育等多種生物學過程，miRNAs的表達改變可能導致某些病理狀態和臨床疾病的發展，因此其在多個系統疾病尤其是腫瘤、自身免疫性疾病等診斷及治療中具有特殊意義。目前miRNAs在甲狀腺領域的研究集中在甲狀腺腫瘤及自身免疫性甲狀腺疾病如HT、Graves病等方面。多項研究表明，HT患者存在miRNAs的異常表達，部分有潛在生物學及臨床意義的miRNAs被不斷發現，對其深入探討有助于進一步從基因層面闡述HT的發病機制、疾病發展及預后，從而為HT防治提供新的思路。

二、發病機制相關miRNAs研究

HT作為AITD的一種類型，是在特定易感基因和環境等多因素相互作用下，繼發自身免疫耐受機制受損，進而導致甲狀腺濾泡細胞破壞并引起最終的甲狀腺功能減退的一類疾病。HT的病因及病理機制研究目前尚未完全闡明。

1.miRNAs與HT相關遺傳因素：HT是一種多基因遺傳疾病，發病具有家族聚集性，遺傳因素在其發病中起到關鍵作用，并已在相應的孿生子及家系研究中得到證實。人類白細胞抗原(HLA)、細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)等被證明是HT重要的易感基因[3,4]。SEPS1基因啟動子遺傳變異、TSHR、ZFAT、IL1RN多態性也可能與HT易感性及嚴重程度相關[5,6]。ZFAT基因位于染色體8q24上的AITD易感基因位點上，其編碼的蛋白質可能與DNA結合，并作為參與細胞凋亡和細胞存活的轉錄調節因子發揮作用，而miR-183-5p已證實可靶向調控ZFAT基因，從而在HT的發病中發揮作用。MiRNAs是基因表達的重要調控因子，而miRNAs編碼基因多態性也被認為與多種疾病包括HT的發病相關。吳平平[7]研究表明，miRNA499(rs3746444)的T/C基因多態性與HT相關，并可能作為篩選HT高危人群的分子標志物。Inoue等[8]通過對編碼miR-125a的MIR125A基因中的rs12976445 C/T、rs10404453A/G和rs12975333G/T多態性進行基因分型,并對外周血單核細胞(PBMC)中miR-125a的表達進行檢測，指出PBMC中的miR-125a表達及其rs12976445 C/T的基因多態性與AITD發展和預后均相關。

2.miRNAs與HT相關環境因素：環境因素是HT的另一重要病理因素，主要包括公共衛生、碘異常、硒和維生素D缺乏、吸煙、化學污染、核輻射、藥物及感染等方面。碘是目前研究較為廣泛的因素之一，過量的碘攝入與HT患病率上升有一定聯系，而碘缺乏同時也是甲狀腺抗體陽性的危險因素[9]。鈉碘轉運體抗體(NISAb)被發現在HT中高表達，并可能在HT的病理進程中發揮一定作用。一項有關甲狀腺癌的研究指出，miR-146a-3p可直接結合并抑制鈉碘轉運體(NIS)轉運碘至細胞內的功能，抑制甲狀腺激素的合成，對miR-146a-3p的抑制則恢復了NIS的表達和功能，增加了放射性碘的攝取[10]。據此推測，部分miRNAs可能通過影響NIS的表達及功能從而在HT的發病進程中發揮一定作用。硒與甲狀腺也有密切關系，甲狀腺組織中的硒含量高于體內其他器官，硒蛋白可調節機體氧化還原狀態，保護甲狀腺細胞免于氧化損傷。此外，硒還參與甲狀腺激素的激活，并在免疫系統功能中發揮作用。低硒狀態被認為與HT的風險增加及甲狀腺纖維化相關，在硒攝入量低的地區增加硒攝入可以降低這些疾病的風險[11]。一項針對腸細胞系的研究表明，硒缺乏可改變多達50個基因和12個miRNAs的表達，其中miR-185在硒蛋白GPX2和SEPHS2表達上調中起重要作用，被認為可能有助于硒蛋白的合成，進一步表明微量元素的補充可調節細胞miRNAs表達譜[12,13]。此外，多種病毒也被認為可能是AITD發展的環境因素之一，如人類皰疹病毒(HHV-6A)感染被認為與HT發病相關。HHV-6A感染可誘導甲狀腺細胞中miR-155_2表達減少和miR-1238表達增加，以及T淋巴細胞中幾種自身免疫相關miRNAs(包括miR-16_1、miR34a、miR-130a、miR-143_1、miR-202、miR-301b、miR-302c、miR-449b、miR-451_1和miR-1238_2)的表達水平增加，從而參與HT的發生、發展過程[14]。

3.miRNAs與HT相關免疫因素：HT作為一種器官特異性的自身免疫性甲狀腺炎，其發生主要由異常的Th1、Th17、Treg和CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTLs)所介導，致使甲狀腺上皮細胞破壞及HT發生[15]。miRNAs廣泛存在于真核生物細胞內，部分miRNAs被證明在調節免疫功能及維持免疫穩態中發揮重要作用。循環miRNAs是近期miRNAs領域的研究熱點，是指穩定存在于血漿、血清及其他體液中的一類miRNAs。一般認為，循環miRNAs來自于細胞的主動分泌、凋亡或壞死細胞的釋放及循環細胞的裂解，其表達可隨個體的生理及病理狀況改變發生相應的變化。多種miRNAs在HT不同組織類型如甲狀腺組織及循環中異常表達，并通過多種途徑調節靶基因，參與調節分化或激活免疫細胞和免疫反應，從而在HT的疾病進程中發揮作用[16]。在HT甲狀腺組織細胞中，miR-141、miR-155_2出現下調，而miR-142-3p、miR-142-5p、miR-146、miR-200a1、miR-326等上調。在PBMC中let-7e中、miR-326表達量上調，miR-29a-3p、miR-155*_1、miR-155_2、miR200a_1、miR200a2*下調。在循環miRNAs方面，HT血漿中miR-20a-3p、miR-205、miR-296、miR-375、miR-451、miR-500a等均呈現上調，而在血清中miR-21、miR-22、miR-142-5p、miR-375和miR-451等的表達量表現為上調[8,15,17～25]。詳見表1。

miR-142、miR-146以及miR-155是目前研究相對深入的幾種miRNAs。miR-142在多種腫瘤如肝癌、結直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌中表達下調，被認為是一種抑癌基因。Zhu等[22]研究表明，miR-142-3p、miR-142-5p和miR-146a在HT患者甲狀腺組織中均有高表達(P<0.001)。其中，miR-142-3p在調控免疫細胞的炎性反應過程中具有重要作用，miR-142-5p與甲狀腺球蛋白抗體水平(TGAb)呈正相關,并可能通過調控Claudin-1(CLDN1)蛋白影響HT發病。miR-146可負性調節炎癥和固有免疫反應,與炎癥以及多種自身免疫性疾病均密切相關,其在人及小鼠甲狀腺組織中均表現出上調趨勢，被認為可能參與CD4+細胞功能異常，從而參與炎癥發展，并有望作為疾病治療的潛在靶點。miR-155被證明在免疫細胞的分化、成熟及維持免疫平衡等生物過程中均起關鍵調控作用,若表達失調可引起炎癥及多種自身免疫性疾病。miR-155*_1/miR-155_2被發現在PBMC中表達下調，而血清中miR155及小鼠甲狀腺組織中則表達上調，推測其可能與miRNAs的時空特異性與組織特異性相關。此外，有研究表明，miR-155與患者血清促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平有一定的相關性，認為miR-155可能通過影響Th1、Th17等CD4+T 細胞亞群的分化偏移，并分泌炎性細胞因子，從而參與HT的發生、發展過程[26]。

表1 HT相關miRNAs組織表達情況研究

三、miRNAs在HT診斷中的作用

HT的診斷主要以臨床癥狀、甲狀腺相關抗體(主要是TPOAb和甲狀腺球蛋白抗體TgAb)、甲狀腺超聲等檢查來確定。然而，臨床中有部分患者因癥狀體征不典型、檢查結果不明確或疾病本身因素，導致其與甲狀腺癌、Graves病等的鑒別診斷存在一定困難。miRNAs尤其是循環miRNAs，作為一類穩定存在于細胞內及體液中的miRNAs,有望作為HT的生物標志物，在HT的診斷分型、鑒別診斷中得到運用。

1. miRNAs與HT分型：近年來，部分研究者提出了將HT分為IgG4相關性HT及非IgG4相關性HT的分類方法。IgG4相關性HT作為HT的一種亞型，具有患病人群趨于年輕化、較高的血清甲狀腺自身抗體水平、更易形成甲狀腺結節及甲狀腺纖維化等臨床特征，逐漸受到醫學界重視[27]。IgG4相關性HT在2009年由Li等首次提出，其根據甲狀腺組織中IgG4免疫組化染色結果將HT病例分為IgG4相關HT及非IgG4相關HT，并指出IgG4相關性HT組與非IgG4相關HT組相比，具有獨特的臨床、血清學及影像學特征。研究表明，IgG4陽性HT患者甲狀腺組織病理切片中生長因子-βl(TGF-βl)表達水平顯著高于IgG4陰性HT患者[28]。TGF-β通路被認為與組織纖維化、惡性腫瘤發生、自身免疫紊亂等密切相關，其家族成員中的TGF-β1可通過自分泌或旁分泌的形式調節各種免疫細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等的增殖、分化和活化。TGF-β通路與miRNAs之間關系密切，一方面，TGF-β信號傳導通路在轉錄和轉錄后水平密切參與miRNAs的合成與控制、表達；另一方面，miRNAs靶標的預測表明TGF-β信號轉導途徑的多個組分可被多個miRNAs靶向[29]。miRNAs通過調控TGF-β通路參與了肝纖維化、內皮祖細胞的分化、腫瘤形成等多種病理生理學進程，例如miR-125a被證實是 TGF-β的負性調節因子，可靶向調控TGF-β的分泌，在部分嚴重HT中，存在miR-125a高表達情況，這之間可能存在一定聯系[8]。據此推測，miR-125a 在IgG4相關HT及非IgG4相關HT的鑒別中具有一定意義。

2. miRNAs與HT的臨床指標：多種miRNAs被發現與HT患者臨床指標如甲狀腺功能及甲狀腺抗體、甲狀腺體積有一定關系。AITD患者血清中異常表達的miR-155與患者血清TSH水平呈負相關[19]。此外，miR-451、 miR-375、miR-500a與HT患者的TSH水平相關，miR-20a-3p則與TgAb水平相關[18]。HT患者血清miR-155表達量與 TPOAb 水平可能存在正相關[26]。HT患者T細胞中miR-29a-3p下調并與低血清FT4，高血清TSH和甲狀腺超聲檢查發現的甲狀腺體積縮小有關[15]。

3.HT的鑒別診斷：(1) HT與甲狀腺癌的鑒別：HT與甲狀腺腫瘤尤其是甲狀腺乳頭狀癌關系密切，HT合并甲狀腺癌的發生率逐年升高。部分研究認為，HT中可能存在一些微小不典型增生病灶，與甲狀腺乳頭狀癌病灶難以區分，并推測HT是甲狀腺腫瘤的癌前病變[30]。因此，準確鑒別二者至關重要。部分差異表達的miRNAs可作為區分HT與甲狀腺癌的分子標志物。例如miRNA-141在HT組織中表達較典型乳頭狀甲狀腺癌及正常甲狀腺組織明顯下調，有望成為區分HT與正常組織或典型甲狀腺乳頭狀癌的一個重要組織標志物[21]。(2) HT與正常人群的鑒別：miR-142-5p在原發性HT甲狀腺組織中的表達顯著性升高，有望作為HT的組織特異性miRNAs標志物[31]。Zhao等[18]通過對血漿miRNAs表達分析，發現與正常對照組比較，HT患者血漿中6種miRNAs(miR-205、miR-20a-3p、miR-375、miR-296、miR-451、miR-500a)的表達均顯著上調，認為其均可作為HT的血漿診斷標志物。另一項研究結果表明，在AITD、HT、Graves病緩解期和輕度HT患者中，PBMC中miR-146a的表達水平分別比健康對照組高296%、328%、348%和464%(P值分別為0.044、0.027、0.027和0.005)。在嚴重HT患者中，血漿中miR-155的表達水平增加至健康對照組的347%(P=0.026)[32]。因此，這些顯著差異表達的miRNAs均可能作為生物標志物用于HT與正常人群的鑒別之中。(3) HT與Graves病的鑒別：HT與Graves病(Graves disease，GD)均屬于AITD范疇，二者發病機制類似，臨床均可出現代謝異常和甲狀腺腫大等癥狀，影像診斷中也有諸多相同之處，在臨床鑒別中有時存在較大難度。研究表明，HT患者PBMC中miR-223-3p的表達水平與GD比較明顯升高[33]。另一項研究指出，HT患者中PBMC中let-7e的表達水平較GD患者和健康對照者顯著增加(P分別為0.000、0.001)。因此，miR-223-3p及let-7e均可能作為miRNAs標志物用于二者的鑒別診斷。

四、miRNAs在HT治療及預后評估中的應用

目前HT的治療一般以甲狀腺素制劑、免疫抑制劑等為主，miRNAs是在轉錄后水平調控基因表達的重要調節因子，通過調控miRNAs治療疾病也是可能的切入途徑。例如miRNA靶向藥物miravirsen已進入臨床試驗階段用于治療慢性丙型肝炎病毒感染并顯示出良好治療效果。已有研究表明，miR-326可能靶向Ets-1蛋白，導致碘化物誘導的甲狀腺炎，這可能為miRNAs靶向治療用于治療甲狀腺炎提供理論基礎。相信miRNAs靶向治療劑應用于HT等自身免疫性疾病的診療有望在將來得到實現。對于HT的預后，一般認為大部分HT患者預后良好，但可有自然發展為甲狀腺功能減退的趨勢。Takuse等[33]研究表明，編碼miR27的miR27A功能多態性可能與HT的嚴重程度相關，更多關于miRNAs在治療及預后中的研究尚有待于進一步開展。

五、展 望

HT是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，可導致甲狀腺功能與甲狀腺結構的改變，其病理機制尚未闡明，臨床表現復雜，早期癥狀常不典型，且無針對病因的治療方法，給臨床診治帶來一定困難。近年來，有關miRNAs的研究取得了顯著進展，miRNAs的生物發生過程及其在細胞增殖、分化、凋亡中的作用已得到初步闡明，并且發現miRNAs與甲狀腺腫瘤、良性甲狀腺疾病如HT、Graves病等也有密切聯系。miRNAs的異常表達與HT的發生、發展、預后均相關，因此miRNAs具有良好的應用前景,并有望作為特異性生物標志物及治療靶標應用于臨床診療中。此外，miRNAs在中醫藥方面得到了一定應用，并在疾病的中醫辨證分型、體質辨識、疾病發病機制及中藥藥效闡釋上取得了一定進展，如血瘀證的辨證分型及診斷網絡的構建，乙型肝炎、肝硬化中醫綜合征的發展評估、對川楝子誘導小鼠肝臟損傷的機制闡述及作為潛在的生物標志物評估中藥臨床療效的運用等。而且，外源植物的miRNAs可吸收人體內穩定存在，并產生調控作用,這也為中藥調控機制從miRNAs角度進行闡述提供了新的思路。隨著未來研究的不斷深入，miRNAs不僅有潛力作為HT的診斷標志物、判斷預后的標志及治療靶點，也有望在分子層面進一步揭示祖國傳統醫學的深刻內涵，從而為防治HT提供新的思路。