金屬蛋白硫在體外受精-胚胎移植胎盤及胚胎組織中表達(dá)及意義

趙 亮 孫麗芳 鄭秀麗 劉靜芳 鄭 蓉 王 穎 楊 蕊 張 蕾 于 麗 張 晗

輔助生殖技術(shù)(ART)安全性一直廣受關(guān)注，流行病學(xué)調(diào)查顯示，即使經(jīng)過混雜因素的調(diào)整，輔助生殖圍產(chǎn)期合并癥發(fā)生率高于普通人群，而不孕疾病因素雖然重要，但不是這些不良妊娠結(jié)局的主要因素，其病理生理機(jī)制是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題[1]。人類早期胚胎發(fā)育，需要囊胚外層滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤子宮內(nèi)膜將胚胎黏附,并侵襲和重建子宮血管，形成母胎循環(huán)。金屬蛋白硫是一類富含半胱氨酸的低分子蛋白質(zhì)，其基因位于16號染色體q13區(qū)域，主要位于細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，具有很強(qiáng)的重金屬結(jié)合能力和清除氧自由基的功能，是胎盤組織重要的保護(hù)機(jī)制之一，金屬蛋白硫在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)高于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，在胚胎組織中廣泛表達(dá),對早期胚胎和胎盤發(fā)育具有重要作用[2]。本研究排除不孕因素，與自然妊娠相對照，對體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)來源的早期胎盤絨毛和胚胎組織金屬蛋白硫基因和相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，探討IVF-ET技術(shù)對該基因表達(dá)和功能影響，從胎盤和胚胎早期發(fā)育視角初步探討輔助生殖安全性以及不良妊娠結(jié)局可能的病理生理機(jī)制。

對象與方法

1.研究對象:選取2014～2017年在北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心因為輸卵管因素或者男性因素接受IVF-ET治療患者，患者均是在新鮮周期取卵移植，因雙胎妊娠減為單胎102例孕婦，選擇其中IVF-ET移植術(shù)后雙胎減胎的8例組織標(biāo)本作為研究組(患者年齡23～35歲，平均年齡30.8歲)。102例患者雙胎減為單胎的原因為：高血壓等慢性疾病、子宮畸形、瘢痕子宮、子宮平滑肌瘤、宮頸機(jī)能不全、宮頸癌錐形切除病史或者患者要求。所有減胎術(shù)均由同一位高年資婦產(chǎn)科醫(yī)生在陰道B超引導(dǎo)下施行，通過物理抽吸方法獲得胚胎和胎盤絨毛組織，術(shù)前和術(shù)中不使用任何藥物和激素。于胚胎移植后30～45天施行減胎術(shù)，相當(dāng)于妊娠45～60天。對照組采用非計劃妊娠10例(年齡24～30歲，平均年齡28.9歲)，所有患者月經(jīng)規(guī)律，近3個月未使用激素類藥物，經(jīng)早孕實驗和B超診斷宮內(nèi)妊娠，胚胎和胎盤絨毛組織采用傳統(tǒng)人工流產(chǎn)獲得。研究獲得筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批通過(倫理審批號：2014075)

2.減胎體外受精-胚胎移植(IVF-ET)標(biāo)本獲取：超聲監(jiān)視下，陰道探頭頻率6.5MHz，排空膀胱，取膀胱截石位，常規(guī)消毒鋪巾后，置入裝有穿刺針導(dǎo)架的帶有無菌探頭套的陰道探頭，了解孕囊大小、位置及相互關(guān)系，采用16G雙腔穿刺針，沿超聲穿刺引導(dǎo)線進(jìn)針，穿過引導(dǎo)及子宮壁刺入胚體后，助手用20ml注射器抽吸胚胎組織，觀察有胚胎組織吸出或殘留胚胎無胎心搏動之后，在穿刺針退出的時候，在胚胎和子宮內(nèi)膜交界處吸取胎盤絨毛組織。立即置于熱臺倒置顯微鏡下分離去除血、胚胎組織和其他雜質(zhì)，純化胎盤絨毛，立即送少量胚胎和絨毛組織到細(xì)胞遺傳實驗室進(jìn)行核型檢測，染色體正常組織才能應(yīng)用進(jìn)行后續(xù)研究。自然妊娠采用常規(guī)人工流產(chǎn)術(shù)，同樣送少量胚胎和胎盤絨毛組織到細(xì)胞遺傳實驗室進(jìn)行核型檢測，術(shù)前不使用米索和激素等藥物。

3.胚胎和胎盤絨毛組織處理：胎盤和絨毛組織置入磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后置入10%甲醛溶液中，4℃固定16h，PBS漂洗數(shù)次，經(jīng)50%、70%、95%及無水乙醇逐級脫水后，以二甲苯透明。于58℃浸蠟過夜，次日更換石蠟并繼續(xù)浸蠟4h，然后包埋。包埋好的蠟塊置于4℃冰箱儲存待用。采用Leica RM2135石蠟切片機(jī)切片，厚度6μm，展片于載玻片上42℃烘烤4天，然后密閉存放于4℃冰箱待測。

4.免疫組織化學(xué)：石蠟切片室溫平衡后，二甲苯脫蠟，經(jīng)無水乙醇、95%、70%及50%逐級水合后，蒸餾水清洗。于枸櫞酸鹽緩沖液中95℃微波熱修復(fù)15min以暴露抗原。冷卻至室溫后1%H2O2室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBA清洗，5%BSA封閉30min。鼠抗人AFP抗體(中山金橋生物公司，1∶400稀釋)4℃孵育過夜。次日PBS清洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG(中山金橋生物公司，1∶100稀釋)室溫孵育15min。PBS清洗，二氨基聯(lián)苯胺(美國Dako公司)顯色10min，自來水沖洗以終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染10s，自來水沖洗。經(jīng)乙醇逐級脫水后，二甲苯透明，加拿大樹膠封片。

5.免疫組織化學(xué)結(jié)果判定:免疫組化切片采用日本ECLIPSE 80i專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)(日本Nikon公司)進(jìn)行半定量分析。在相同條件下對同一批染色切片進(jìn)行觀察、圖像采集，通過NIS-Elements3.0軟件對所采集的圖像中陽性部位(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽性表達(dá))進(jìn)行吸光度(A)值的測定，每張?zhí)ケP絨毛和胚胎組織切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取表皮部位各5處，計算陽性表達(dá)的平均吸光度(A)。

6.qRT-PCR 檢測：qRT-PCR 方法檢驗胎盤絨毛和胚胎組織基因表達(dá)。第一鏈互補(bǔ)合成反應(yīng)采用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程大連有限公司)。 qRT-PCR儀PRISM7300進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(美國ABI公司)，GAPDH內(nèi)參，qRT-PCR檢測金屬蛋白硫引物為5′-ACTGCTCCTGCGCCATGGTG-3′，5′-ATTATCATTCACATATTTCAT-3′，GAPDH引物為5′-AAGCCCATCACCATCTTCCAG-3′，5′-TCTTCTGACACCCATCGGGGA-3′。每個qRT-PCR 反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果分析采用DDCt方法。

結(jié) 果

1.臨床資料:兩組妊娠婦女一般情況詳見表1，年齡、停經(jīng)時間、妊娠次數(shù)和體重指數(shù)方面比較，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.金屬蛋白硫在胎盤組織中表達(dá):金屬蛋白硫在早孕胎盤絨毛組織中，表達(dá)于絨毛內(nèi)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞柱，其中在IVF-ET組和自然妊娠組，均可見合體滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)高于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。IVF-ET來源胎盤絨毛組織中金屬蛋白硫表達(dá)吸光度(A)值為0.036±0.004，自然妊娠來源胎盤絨毛組織表達(dá)較強(qiáng)，吸光度(A)值為0.040±0.004，IVF-ET組胎盤絨毛組織金屬蛋白硫表達(dá)低于自然妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1。

表1 兩組妊娠婦女一般情況比較

圖1 金屬蛋白硫在早期胎盤絨毛組織中表達(dá)情況A.金屬蛋白硫在IVF-ET胎盤絨毛組織中表達(dá)(×100)；B.金屬蛋白硫在自然妊娠胎盤絨毛組織中表達(dá)(×100)；C.金屬蛋白硫在IVF-ET胎盤絨毛組織中表達(dá)(×400)；D.金屬蛋白硫在自然妊娠胎盤絨毛組織中表達(dá)(×400)

3.金屬蛋白硫在胚胎組織中表達(dá)：金屬蛋白硫在IVF-ET組和自然妊娠早期胚胎組織中具有廣泛表達(dá)，其中IVF-ET組和自然妊娠組胚胎組織中金屬蛋白硫表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 金屬蛋白硫在早期胚胎組織中表達(dá)情況A.金屬蛋白硫在IVF-ET胚胎組織中表達(dá)(×50)；B.金屬蛋白硫在自然妊娠胚胎組織中表達(dá)(×50)；C.金屬蛋白硫在IVF-ET胚胎組織中表達(dá)(×200)；D.金屬蛋白硫在自然妊娠胚胎組織中表達(dá)(×200)

4.qRT-PCR檢測結(jié)果：qRT-PCR檢測金屬蛋白硫mRNA在早孕胎盤絨毛和胚胎組織中表達(dá)，結(jié)果顯示，IVF-ET胎盤絨毛組織中金屬蛋白硫mRNA低于自然妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IVF-ET組和自然妊娠組胚胎組織中，金屬蛋白硫 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 金屬蛋白硫 mRNA在胎盤絨毛和胚胎組織中表達(dá)情況*P<0.05

討 論

輔助生殖技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，其引起子代風(fēng)險性增高的潛在機(jī)制值得深入探討。研究對1222例單純促排卵治療、554例IVF-ET妊娠以及34286例自然妊娠出生單胎的妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)匹配年齡、種族、教育程度、BMI、吸煙史以及既往早產(chǎn)史之后，輔助生殖技術(shù)明顯增加先兆子癇、前置胎盤、胎盤早剝等胎盤發(fā)育相關(guān)的妊娠并發(fā)癥風(fēng)險[3]。針對輔助生殖中單胎移植的不良妊娠結(jié)局問題并對單胎移植妊娠結(jié)局進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)即使排除多胎移植的影響，輔助生殖單胎移植的妊娠結(jié)局與自然妊娠單胎比較仍然較差，而深入的病理生理機(jī)制不清楚[4]。對歐洲輔助生殖妊娠結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，單胎移植的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率是32%，而不孕疾病因素雖然重要，但并不是這些不良結(jié)局的主要因素，相關(guān)病理生理機(jī)制尚不清楚[5]。

本研究對IVF-ET來源的胎盤絨毛和胚胎組織金屬蛋白硫基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，與自然妊娠比較，發(fā)現(xiàn)在IVF-ET來源胎盤絨毛組織低表達(dá)金屬蛋白硫，而IVF-ET來源胚胎組織中金屬蛋白硫表達(dá)未見明顯差異，qRT-PCR結(jié)果顯示金屬蛋白硫基因IVF-ET組胎盤絨毛相比對照組表達(dá)降低，IVF-ET胚胎組織與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與免疫組織化學(xué)研究結(jié)果一致。金屬蛋白硫是胎盤內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)，作為一種多功能蛋白質(zhì)其作用包括重金屬解毒，必需金屬元素的平衡調(diào)節(jié)，穩(wěn)定細(xì)胞膜、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕鈣超載、DNA損傷保護(hù)，并與血管再生，細(xì)胞存活，凋亡和增殖有關(guān)。參與胎盤局部應(yīng)激反應(yīng)、滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞代謝調(diào)控、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等，保護(hù)細(xì)胞免受外界刺激的損傷和對抗親電子物質(zhì)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)與自然妊娠比較，IVF-ET早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中低表達(dá)金屬蛋白硫，顯示IVF-ET技術(shù)操作或者藥物等影響胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞早期發(fā)育和功能，干擾金屬蛋白硫表達(dá)，進(jìn)而在諸多功能方面影響滋養(yǎng)層細(xì)胞功能。 IVF-ET來源滋養(yǎng)層細(xì)胞低表達(dá)金屬蛋白硫，會影響滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)部微量元素平衡，包括微量元素的儲存、運(yùn)輸和代謝。相關(guān)研究表明，金屬蛋白硫是鋅儲存蛋白，可以與細(xì)胞內(nèi)游離鋅結(jié)合，調(diào)節(jié)鋅水平，參與鋅的儲存、運(yùn)輸及生物利用，維持體內(nèi)鋅、銅平衡，在鋅代謝中有重要作用[7]。本研究結(jié)果顯示，IVF-ET技術(shù)影響胎盤組織鋅動態(tài)平衡進(jìn)而影響其功能。金屬蛋白硫?qū)χ亟饘倬哂薪舛咀饔茫涮厥夥肿咏Y(jié)構(gòu)和金屬親和力，使得其結(jié)合有毒游離金屬離子，緩解重金屬毒性和轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子到肝臟、腎臟器官進(jìn)行解毒和排除[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，金屬蛋白硫在IVF-ET早期胎盤組織中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞均有較低表達(dá)，并且經(jīng)qRT-PCR驗證其基因表達(dá)與組織化學(xué)結(jié)果相一致。金屬蛋白硫一個重要功能是清除自由基，金屬蛋白硫的巰基在自然狀態(tài)下是以還原形式存在，因此具有親核性，容易與某些親電子物質(zhì)包括自由基相結(jié)合，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是拮抗各種活性氧和活性氮所致氧化損傷的抗氧化劑，從而及時清除尚未損傷到靶細(xì)胞的自由基。妊娠早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞代謝旺盛，氧代謝產(chǎn)生的自由基增加由此引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，人體內(nèi)存在自由基產(chǎn)生與清除的酶系統(tǒng)，本研究結(jié)果顯示IVF-ET來源早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞抗氧化能力和自由基清除能力下降，而滋養(yǎng)層細(xì)胞本身是與外界直接接觸，并且在IVF-ET技術(shù)中直接接觸藥物和受到操作的細(xì)胞，其抗氧化損傷能力下降直接影響胎盤發(fā)育和功能[9]。研究表明，鋅離子可以增加金屬蛋白硫的表達(dá)，鋅離子的劑量與金屬蛋白硫的表達(dá)量呈正相關(guān)，可以增加重金屬離子和氧化應(yīng)激對細(xì)胞毒性作用。相關(guān)研究中確實發(fā)現(xiàn)，增加飲食補(bǔ)充鋅離子，可以提高IVF-ET技術(shù)成功率，但是鋅離子的其他作用和機(jī)制尚不清楚，鑒于胎盤復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和強(qiáng)大代償功能，金屬蛋白硫在IVF-ET中對滋養(yǎng)層細(xì)胞功能影響和相關(guān)發(fā)病機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究支持[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與自然妊娠組比較，IVF-ET組胎盤絨毛組織金屬蛋白硫低表達(dá)，IVF-ET組和自然妊娠組胚胎組織中金屬蛋白硫蛋白和基因表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果顯示，相比較胚胎，輔助生殖技術(shù)傾向于影響胎盤功能，與動物模型研究結(jié)果一致[11]。以牛為模型研究，發(fā)現(xiàn)體外受精-胚胎移植牛早期胎盤血管的密度顯著減少，并伴有VEGF mRNA表達(dá)的減少，推測晚期胎盤結(jié)構(gòu)變化是對缺血、缺氧的代償反應(yīng)[12]。以小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)輔助生殖技術(shù)可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力下降和對子宮螺旋動脈重塑不足，是子代小鼠低出生體質(zhì)量和早產(chǎn)的危險因素[13]。輔助生殖技術(shù)對胎盤的影響也表現(xiàn)在足月胎盤組織中，認(rèn)為胎盤血管形成異常是輔助生殖技術(shù)妊娠風(fēng)險的原因之一，同時利用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)輔助生殖技術(shù)胎盤屏障厚度增加，終末絨毛頂端微絨毛減少和完全消失[14，15]。

綜上所述，胎盤作為妊娠期重要的多功能器官，可能是輔助生殖過程中多種影響因素的靶器官，對人輔助生殖早期胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的深入、全面、系統(tǒng)研究，闡明胎盤功能變化的病理生理過程與分子機(jī)制，探尋干預(yù)措施，將有利于提高輔助生殖技術(shù)安全性。