PCBP1對6-OHDA作用的SH-SY5Y細胞凋亡影響的研究

賈冰冰 霍麗蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)主要發生在中老年時期，是一種常見的神經系統退行性疾病，病理上主要表現為黑質多巴胺能神經元的缺失死亡，紋狀體內多巴胺含量減少，路易小體形成。許多研究認為，基因和環境的改變均可導致PD的發生，但神經元細胞死亡的具體機制目前尚不清楚[1]。有研究顯示，將6-OHDA注射入紋狀體內，黑質多巴胺能神經元細胞可出現凋亡和壞死等形態學改變，因此6-OHDA是與PD發病有關一種神經毒素[2]。多聚胞嘧啶結合蛋白1[poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]，是細胞內的一種橋梁蛋白質，PCBP1于哺乳動物的各組織中廣泛分布，PCBP1可參與mRNAs-蛋白復合體的形成及其他多種生物學過程[3]。為了進一步探討毒素作用下的神經元細胞周期是否受到PCBP1的調控作用，應用脂質體轉染的方法將PCBP1全長cDNA的重組質粒轉染SH-SY5Y細胞系，研究在神經毒素6-OHDA作用下,PCBP1對SH-SY5Y細胞周期變化的影響。

材料與方法

1.材料及試劑：SH-SY5Y細胞由北京兒童醫院兒科研究所惠贈；含PCBP1序列的重組質粒(本室構建保存)；胎牛血清、1%青/鏈霉素、1640培養液、小提質粒試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ、TagDNA聚合酶、LipHigh脂質體高效轉染試劑均為上海生物工程有限公司產品；反轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索萊寶生物科技有限公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(四正柏生物公司)；6-OHDA(美國Sigma公司)；流式細胞儀(美國BD Calib公司),倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2.重組pEGFP/N1-PCBP1質粒構建和鑒定：采用PCR擴增PCBP1目的序列，引物含有EcoRⅠ酶切位點，pcbp1的PCR擴增引物：TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG和TTCTAGAATTCA-ACCTACACTGTTCTAGCTGCACC；應用PCR反應混合物：模板<1μg，上下游引物(10μmol/L)各2μl，2×Master Mix 25μl，加水補足至50μl。PCR反應循環設置：94℃，4min；再設30個循環:94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；最后72℃，5min。之后將PCR產物純化、EcoR酶I切后與質粒pEGFP-N1連接，轉化大腸桿菌Dh5α。通過克隆篩選，擴增，經測序證明PCBP1正確重組到pEGFP/N1質粒上。

3.SH-SY5Y細胞培養及轉染：取對數生長期的SH-SY5Y細胞以1×106個/ml接種于60mm細胞培養皿中，于含1%青霉素和鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，37℃，5%CO2培養箱中進行培養，待細胞生長至密度接近70%～80%時，將細胞培養液更換為不含抗生素的培養基。取4μg pEGFP/N1-PCBP1(實驗組)或pEGFP/N1質粒(對照組)滴加至250μl的1640培養基，同時將10μl的脂質體滴加250μl的1640培養基，緩慢混勻，室溫靜置5min后，將兩種質粒混合物分別加入脂質體混合物中，緩慢混勻后室溫靜置20min，形成兩種轉染工作液。將上述轉染工作液逐滴加入細胞培養基中，于培養箱中繼續培養8h后，更換為含抗生素的完全培養基。于瞬時轉染24h時，在倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光蛋白表達。

4.6-OHDA作用于兩組細胞：將SH-SY5Y細胞以1×105/ml密度接種到12孔板內，每孔1ml；細胞生長至密度70%～80%時，細胞饑餓處理后分別將pEGFP/N1-PCBP1質粒(實驗組)和pEGFP-N1質粒(對照組)按照前述方法轉染SH-SY5Y細胞。轉染24h時，分別將終濃度為5、15、25μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組SH-SY5Y細胞中，繼續培養24h；另將終濃度為25μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組細胞中，繼續培養4、8、24h后進行流式檢測。

5.細胞周期檢測：將不同處理組的細胞收集到離心管內，5min，1000×g離心；棄上清，向離心管中加入1ml PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，棄上清；用1×結合緩沖液重懸細胞，取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE混勻后于室溫避光孵育5min；加入7AAD 10μl，并加入500μl PBS,進行流式檢測。

結 果

1.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1鑒定：根據載體質粒特征性限制性酶切位點的位置，用EcoR I進行酶切后，理論上應產生4700和1070bp兩個片段。經限制性內切酶酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1顯示，重組質粒大小、酶切片段大小和理論值一致，經測序鑒定PCBP1 cDNA序列插入正確。

圖1 EcoR Ⅰ酶切產物瓊脂糖凝膠電泳分析M.Maker；1.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1 EcoRⅠ酶切產物電泳；2.空載質粒pEGFP-N1 EcoRⅠ酶切產物電泳

2.6-OHDA對轉染PCBP1重組質粒和空載質粒的細胞凋亡的影響：將不同濃度6-OHDA 作用于兩組SH-SY5Y細胞不同時間后，流式細胞儀分析結果顯示，5、15、25μmol/L 6-OHDA對實驗組和對照組細胞作用24h后，轉染PCBP1重組質粒的細胞早期凋亡率低于轉染空載質粒組，差異有統計學意義(表1，圖2，P<0.05)；轉染PCBP1重組質粒和轉染空載質粒的細胞晚期凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。25μmol/L 6-OHDA分別對實驗組和對照組細胞作用8、16、24h后(表2，圖3)， 轉染PCBP1重組質粒的細胞早期凋亡率低于對照組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)；轉染PCBP1重組質粒和空載質粒的細胞晚期凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率比較

對照組為轉染空質粒pEGFP/N1的SH-SY5Y細胞；實驗組為轉染重組質粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y細胞。實驗組與對照組比較，P<0.05

討 論

近年來，細胞凋亡分子機制相關研究表明，多巴胺神經元細胞的凋亡以及變性壞死是PD的一個重要發病機制，那么如何抗凋亡必然成為緩解PD發病的重要關注點。PCBP1屬于核不均一核糖核蛋白亞家族的一個成員，可在各種分子水平上參與基因表達的調控：如DNA復制與轉錄，mRNA向胞核內轉入與轉出，mRNA翻譯和穩定性的調控，并且可參與蛋白與核酸及蛋白與蛋白之間的相互作用[4，5]。已有研究表明，PCBP1參與腫瘤發生、發展，病毒基因表達，鐵轉運等方面的調控作用。目前，PCBP1在神經系統疾病發生、發展中的調控作用逐漸受到關注。有研究表明PCBP1與神經纖維的發育有密切關系，隨著軸突的發育成熟，軸突細胞骨架成熟及軸突口徑增加可能與NF-M mRNA穩定性提高有關，而該穩定性增加源于PCBP1的KH同源域識別NF-M 3′-UTR的CU富含位點，進而促進NF-M mRNA水平增加、軸突成熟[6]。

圖2 不同濃度6-OHDA對實驗組和對照組細胞作用24h后細胞凋亡率的流式分析A～C為對照組細胞;A.5μmol/L 6-OHDA;B.15μmol/L 6-OHDA;C.25μmol/L 6-OHDA；D～F為實驗組細胞;D.5μmol/L 6-OHDA;E.15μmol/L 6-OHDA;F.25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

表2 25μmol/L 6-OHDA作用不同時間后的兩組細胞凋亡率比較

對照組為轉染空質粒pEGFP/N1的SH-SY5Y細胞；實驗組為轉染重組質粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y細胞。實驗組與對照組比較，P<0.05

圖3 25μmol/L 6-OHDA對兩組細胞作用不同時間后細胞凋亡率的流式分析A～C為對照組細胞;A.6-OHDA作用8h;B.6-OHDA作用16h;C.6-OHDA作用24h；D～F為實驗組細胞;D.6-OHDA作用8h;E.6-OHDA作用16h;F.6-OHDA作用24h；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

PCBP1可參與細胞增殖、凋亡及周期變化等生物學事件。本課題研究者通過動態貝葉斯網絡分析發現，PCBP1可調控7個轉錄因子的活性和表達。其中，一部分轉錄子可參與細胞周期及凋亡的調節，如TP53、FOS、FST[7]。另外，將PCBP1轉染神經元細胞系SH-SY5Y細胞后，與轉染對照質粒的細胞比較，細胞一定程度上加速生長，提示PCBP1對神經細胞的生長發育有一定的調節作用[8]。Nishimura等[9]研究發現PCBP1與ORF57相互作用可提高脊髓灰質炎病毒內核糖體進入位點(internal ribosome-entry site,IRES)的轉錄，以及X相關的凋亡抑制子(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)活性。在脊髓灰質炎病毒中，ORF57表達增加時，XIAP活性可伴隨提高。因此，PCBP1可通過與ORF57相互作用，而參與病毒基因的調節。那么，6-OHDA是一種神經毒素,可致細胞凋亡/死亡,是構建帕金森病細胞/動物模型常用的一種毒素，PCBP1對6-OHDA作用的神經細胞凋亡是否有影響，具體影響到什么階段是本項研究的關注點。研究經流式細胞儀分析發現，不同濃度的6-OHDA對SH-SY5Y細胞作用24h后，實驗組與對照組比較，細胞早期凋亡率明顯較低(P<0.05)。同等劑量的6-OHDA對SH-SY5Y細胞作用不同時間后，實驗組較對照組細胞的早期凋亡率明顯較低(P<0.05)，提示在細胞早期凋亡階段，PCBP1可以起到一定程度的抗凋亡作用。

然而，本研究中不同濃度的6-OHDA作用相同時間以及同等劑量6-OHDA作用不同時間均顯示實驗組和對照組的細胞晚期凋亡率比較，差異無統計學意義。提示神經病變細胞進入晚期凋亡后，PCBP1的參與仍然無法抗衡細胞凋亡的結局，研究神經元變性細胞早期凋亡階段，PCBP1提高細胞抗凋亡能力的調控機制和調控作用，將對于PD等神經變性病的發生、發展及預后具有一定的意義。