甘草素對(duì)大鼠肝臟冷缺血損傷的影響及其機(jī)制

劉向東 蘇 松 羅 德 陳鑫培 周鵬程 李 波

肝移植是目前治療終末期肝病和急性肝衰竭的唯一有效的方法，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)廣泛開(kāi)展。然而，原發(fā)性移植肝無(wú)功能和功能延遲仍然是限制肝移植的應(yīng)用及其成功率的主要原因。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)這些并發(fā)癥的發(fā)生可能與供肝在冷保存過(guò)程中所遭受的冷缺血損傷有著密切的關(guān)系[1,2]。冷缺血通過(guò)激活肝竇上皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性細(xì)胞因子，被認(rèn)為是降低移植肝功能的重要因素[3,4]。因此，進(jìn)一步研究肝臟冷缺血損傷機(jī)制并探索有效的拮抗手段已成為目前肝移植界重要的研究方向之一。甘草素(glycyrrhizin，GL)是從甘草類植物光果甘草的根中提取的一種三萜類化合物，具有抗炎作用，已經(jīng)被廣泛用于乙型和丙型肝炎病毒引起的慢性肝炎患者[5]。最近的一項(xiàng)研究表明，GL可以通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)，從而降低肝臟熱I/R損傷[6]。然而，GL對(duì)于肝臟冷缺血損傷的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)模擬肝移植供肝冷保存過(guò)程，探討在大鼠模型中GL對(duì)肝臟冷缺血損傷的作用及其潛在機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑：選取健康成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～350g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(111)2018-065，按實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)方法分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前1天禁食，可自由飲水。Krebs-Henseleit(KH)緩沖液的配制：20mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N02-乙磺酸(HEPES，pH值為7.4)，115mmol/L NaCl，25mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)，5.9mmol/L氯化鉀(KCl)，1.2mmol/L氯化鎂(MgCl2)，1.2mmol/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，1.2mmol/L硫酸鈉(Na2SO4)，2.5mmol/L氯化鈣(CaCl2)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，兔抗HMGB1的多克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，兔抗TLR4的多克隆抗體和兔抗NF-κB p65多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Biosource公司，TUNEL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Oncor公司。

2.肝臟手術(shù)與保存：采用氯胺酮(70mg/kg)和甲苯噻嗪(30mg/kg)腹腔注射麻醉。行腹部正中切口，暴露肝臟。膽總管、門(mén)靜脈和肝上下腔靜脈使用聚乙烯導(dǎo)管插管。然后于室溫下使用經(jīng)濾過(guò)和氧化(95%O2/5%CO2)的KH緩沖液原位灌注肝臟，速度約為20ml/min。再用75ml冷(4℃)組氨酸-色氨酸-酮戊二酸(histidine-tryptophan-ketoglutarate，HTK)溶液沖洗后，取出肝臟，最后于冷保存液中保存24h。保存液為不含GL的HTK溶液(HTK組，n=30)和50、100、150g/L的GL，分別為低劑量(LGL，n=30)，中劑量(MGL，n=30)和高劑量(HGL，n=30)組。對(duì)照組(sham，n=30)的肝臟取出后立即行再灌注。

3.肝臟灌注：冷保存后的肝臟，使用5ml冷KH緩沖液經(jīng)門(mén)靜脈灌注，收集灌流液以測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)水平。然后將肝臟連接到灌注裝置，使用KH緩沖液在37℃(pH值為7.4)下進(jìn)行灌注，流速為20ml/min，時(shí)間為60min。膽汁使用稱重過(guò)的燒杯收集。

4.蘇木精-伊紅染色：在冷藏與KH緩沖液灌注后，切除肝左葉，使用甲醛溶液固定，石蠟包埋和切片(3mm)。蘇木精-伊紅染色后，于光鏡下觀察。采用Wu等[7]建立的肝損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)明顯病理改變；1分，<10%；2分，11%～50%；3分，>50%肝細(xì)胞腫脹和胞質(zhì)空泡化。切片以雙盲的方式由2名觀察者進(jìn)行分析，每個(gè)切片中選擇5個(gè)視野，計(jì)算平均得分。

5.LDH與膽汁水平測(cè)定：通過(guò)分光光度法分析灌流液中LDH水平以評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度。通過(guò)測(cè)量60min再灌注期間膽管總插管的膽汁分泌來(lái)評(píng)價(jià)肝功能情況。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：利用Trizol法從肝臟組織中提取細(xì)胞總RNA，使用Prime Script RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用HMGB1基因特異性TaqMan探針，TaqMan Fast Universal 預(yù)混液，StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR操作系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)的引物序列為5′-TAAAAAGCCGAGAGGCAAAA-3′，5′-GCAGACATGGTCTTCCACGT-3′。結(jié)果用Ct值分析，以β-肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

7.免疫組化：用免疫組織化學(xué)染色法分析HMGB1、Toll樣受體4(TLR4)和核因子(NF)-κB的表達(dá)。首先，石蠟切片用二甲苯脫蠟，乙醇水化，并在1%的過(guò)氧化氫溶液中孵育10min。然后用兔抗HMGB1的多克隆抗體(1∶250)、兔抗TLR4的多克隆抗體(1∶200)和兔抗NF-κB p65多克隆抗體(1∶200)在室溫下孵育30min。其次使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，加入生物素化山羊抗兔第二抗體孵育30min。最后使用AB酶試劑孵育30min，加入過(guò)氧化物酶底物，蘇木精復(fù)染10s。顯微鏡下觀察切片，在每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，測(cè)量每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，計(jì)算每個(gè)切片的平均百分比。

8.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：使用特定的大鼠ELISA試劑盒測(cè)量灌流液中的炎性介質(zhì)(TNF-α、IL-6)水平。

9.肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)：使用TUNEL試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，每張切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

結(jié) 果

1.GL降低冷保存后肝臟LDH釋放：肝細(xì)胞LDH的釋放是肝臟損傷的重要指標(biāo)。在HTK溶液中冷保存24h后，灌流液中LDH水平與對(duì)照組比較顯著增加(2549.7±681.8U/L vs 65.3±9.5U/L，P=0.000)。與未加GL的HTK溶液比較，加入GL的HTK溶液顯著抑制了LDH的釋放(LGL：1573.7±298.6U/L；MGL：1290.6±188.9U/L；HGL：627.8±192.3U/L，P均=0.000)。GL的抑制活性呈濃度依賴性(HGL vs LGL，HGL vs MGL，P均=0.000，圖1)。

圖1 冷保存24h釋放的LDH水平與Sham組比較，*P<0.01；與HTK組比較，#P<0.01；與HGL組比較，ΔP<0.01

2.GL改善再灌注后膽汁分泌：膽汁分泌水平是再灌注后肝功能恢復(fù)程度的重要標(biāo)志物。與對(duì)照組比較，在HTK溶液中冷保存24h后的肝臟膽汁分泌顯著減少(32.5±5.5μl/g vs 49.7±3.1μl/g，P<0.01)，提示肝臟功能受損。與未加GL的HTK溶液比較，加入GL的HTK溶液的顯著增加了膽汁的分泌(LGL：34.8±6.2μl/g，P<0.05；MGL：42.8±9.3μl/g，P<0.01；HGL：46.3±8.2μl/g，P<0.01,圖2)。

圖2 灌注60min后膽汁分泌水平與HTK組比較，*P<0.01；與LGL組比較，#P<0.05

3.GL減輕肝組織損傷和減少肝細(xì)胞凋亡：肝組織損傷采用組織病理學(xué)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)保存24h的肝臟進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。如圖3所示，對(duì)照組的肝臟損傷組織病理學(xué)評(píng)分最低(0.2±0.1分)，提示肝組織損傷最小。相反，保存在冷HTK溶液中的肝臟則有顯著較高的評(píng)分(2.6±0.5分)，而與未加GL的HTK溶液比較，GL的加入明顯降低了病理組織學(xué)評(píng)分(LGL：1.5±0.4；MGL：1.3±0.5；HGL：1.0±0.5；P均<0.01)。此外，與HTK組比較，MGL組和HGL組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(MGL：13.2%±3.5%；HGL：8.3%±2.1%；HTK：21.1%±6.3%；MGL vs HTK，P<0.05；HGL vs HTK，P<0.01)。與LGL組和MGL組比較，HGL組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P均<0.01，圖4)。

圖3 各組肝臟的組織病理學(xué)改變(HE，×400)A.對(duì)照組；B.HTK組；C.LGL組；D.MGL組；E.HGL組；與對(duì)照組比較，*P=0.000；與HTK組比較，#P<0.01；與HGL組比較，ΔP<0.01

圖4 各組肝臟的肝細(xì)胞凋亡情況(TUNEL,×400)A.HTK組；B.LGL組；C.MGL組；D.HGL組；與HTK組比較，*P<0.05；與HGL組比較，#P<0.01

4.GL下調(diào)冷缺血后HMGB1-TLR4的表達(dá)：如圖5免疫組化染色結(jié)果所示，HTK溶液冷保存肝臟相比對(duì)照組HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加(8.09%±1.73% vs 1.69%±0.42%，P<0.05)。此外，HMGB1在冷保存后的肝臟中從肝細(xì)胞的細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。肝細(xì)胞TLR4的表達(dá)在HTK溶液中貯存后也呈上調(diào)趨勢(shì)(圖6)。TLR4陽(yáng)性細(xì)胞在HTK溶液冷保存肝臟中的百分比顯著高于對(duì)照組(9.1%±1.9% vs 1.8%±0.6%，P<0.01,圖7)。相反，與不含GL的HTK溶液冷保存的肝臟比較，LGL、MGL和HGL組HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著降低(LGL:5.16%±0.93%，MGL:4.44%±0.73%，HGL:2.01%±0.65%，P均<0.01)，且呈濃度依賴性(圖5)。TLR4陽(yáng)性細(xì)胞在LGL(5.3%±2.2%)、MGL(4.1%±1.4%)和HGL(2.5%±0.7%)中的比例也顯著低于HTK組(9.1%±1.9%，P均<0.01,圖7)。

圖5 冷缺血后HMGB1 mRNA以及蛋白的表達(dá)情況(免疫組化,×400)A.HMGB1 mRNA表達(dá)情況；B.HMB1免疫組化染色；a.對(duì)照組；b.HTK組；c.LGL組；d.MGL組；e.HGL組；C.HMGB1 蛋白表達(dá)情況；與HTK組比較，*P<0.05；與HGL組比較，#P<0.01

圖6 NF-κB/p65(A～E)和TLR4(F～J)的表達(dá)情況(免疫組化,×400)A、F.對(duì)照組；B、G.HTK組；C、H.LGL組；D、I.MGL組；E、J.HGL組

圖7 TLR4蛋白的表達(dá)指數(shù)與HTK組比較，*P<0.01；與HGL組比較，#P<0.05

圖8 NF-κB/p65蛋白的表達(dá)指數(shù)與HTK組比較，*P<0.05；與HGL組比較，#P<0.05

5.GL抑制NF-κB的活化和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)：如圖6和圖8所示，在HTK溶液中儲(chǔ)存的肝臟中NF-κB/p65陽(yáng)性細(xì)胞比例(10.3%±2.6%)顯著高于對(duì)照組肝臟(2.7%±0.7%,P<0.01)。加入GL的HTK溶液中儲(chǔ)存的肝臟NF-κB/p65陽(yáng)性細(xì)胞的比例呈濃度依賴性下降(LGL:6.3%±2.2%,P<0.05；MGL:5.8%±1.7%,P<0.01；HGL:3.6%±1.4%,P<0.01)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未加GL的HTK溶液冷保存肝臟比較，加入GL的HTK溶液冷保存肝臟的炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α明顯降低，且呈濃度依賴性(P<0.01,圖9)。

圖9 IL-6和TNF-α的表達(dá)情況與對(duì)照組比較，*P<0.01；與HTK組比較，#P<0.01；與HGL組比較，ΔP<0.01

討 論

低溫的保護(hù)作用已經(jīng)廣泛應(yīng)用于器官和組織的儲(chǔ)存過(guò)程中。然而不足的是，在其發(fā)揮保護(hù)作用的同時(shí)，也會(huì)引起肝細(xì)胞的損傷，極大的限制了移植器官的保存以及邊緣供體的使用[7，8]。因此，尋找一種新的方法提高冷保存的效果對(duì)于減輕肝臟冷保存損傷、提高肝移植物成活率具有及其重要的意義。

GL是甘草根中的主要活性成分，由甘草酸和葡萄糖醛酸組成，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和保肝等多種藥理作用。在亞洲地區(qū)，GL已被廣泛用于治療慢性病毒性肝炎[9，10]。近期研究表明，GL可以通過(guò)抑制HMGB1的細(xì)胞因子活性對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入GL的HTK溶液能顯著降低冷保存后肝臟LDH釋放，增加膽汁分泌，減輕肝組織損傷以及減少肝細(xì)胞凋亡，上述作用隨著GL濃度的變化而變化，這說(shuō)明GL對(duì)于肝臟的冷缺血損傷也具有明顯的保護(hù)作用，并且其保護(hù)作用具有濃度依賴性。

HMGB1是一種非染色體核蛋白，主要由缺血或壞死的細(xì)胞釋放，并介導(dǎo)炎性反應(yīng)、細(xì)胞死亡和多種器官組織的缺血再灌注損傷[11～13]。Gong等[5]的研究結(jié)果顯示，GL可作為HMGB1抑制劑，對(duì)局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。研究表明，GL對(duì)大鼠缺血再灌注后引起的肝臟損傷的預(yù)防作用可能與抑制Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生HMGB1有關(guān)[6]。HMGB1通過(guò)與多個(gè)受體相互作用而發(fā)揮作用，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和TLR[14]。TLR4是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要受體，在缺血性損傷中也起著重要的作用。Zhu等[15]報(bào)道，在心臟移植模型中，HMGB1-TLR4-IL-23-IL-1A軸參與了炎性反應(yīng)因子的分泌，從而導(dǎo)致心臟損傷。

此外，還有研究報(bào)道了HMGB1-TLR4信號(hào)通路參與了小鼠腸道的缺血再灌注損傷[16]。HMGB1-TLR4信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)致使NF-κB的活化和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。NF-κB是一種與免疫球蛋白基因的κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。它通過(guò)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷。因此，本研究探索了HMGB1-TLR4信號(hào)通路與GL對(duì)于肝臟冷缺血損傷保護(hù)作用中的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，加入GL的HTK溶液能顯著下調(diào)冷缺血后HMGB1和TLR4的表達(dá)，同時(shí)也抑制了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB的活化。炎性細(xì)胞因子TNF-α與IL-6的表達(dá)也隨著GL的加入而降低。這些結(jié)果表明，GL可能通過(guò)抑制HMGB1和TLR4的表達(dá)，減少NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的釋放，從而減輕肝臟的冷缺血損傷。

綜上所述，GL能明顯減輕肝臟的冷缺血損傷，其機(jī)制可能與抑制HMGB1-TLR4信號(hào)通路有關(guān)。但此結(jié)論需在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。