妊娠期糖尿病TNF-α與VCAM-1的表達及相關性研究

趙莉莉 楊筱青

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是發生在妊娠期的一種常見病理狀態，增加了孕產婦和圍生兒并發癥的發生率[1]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰島素抵抗和與亞臨床炎癥有關的血管內皮細胞功能障礙，胰島素是通過血管內皮細胞發揮作用，當血管內皮細胞受損時可引起胰島素抵抗，發生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管內皮細胞損傷在妊娠期糖尿病發病機制中起重要作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種促炎性細胞因子，在體外將TNF-α添加到原代人臍靜脈內皮細胞的實驗中發現TNF-α可誘導血管內皮細胞功能障礙[3]。血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是內皮功能障礙的生物標志物[4]。VCAM-1可結合存在于白細胞上的配體，促進白細胞附著于血管內皮細胞，導致血管內皮細胞損傷[5]。目前國內關于TNF-α在GDM的血管內皮細胞損傷發病機制方面還未見文獻報道，關于VCAM-1在GDM中的研究甚少。本研究通過測定正常孕婦和妊娠期糖尿病患者血漿、胎盤中TNF-α、VCAM-1的表達，測定所有研究對象血中空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(hemoglobinA1c,HbA1c)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein,LDL-C)、載脂蛋白A(apolipoprotein A, APOA)和載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)的水平，探討TNF-α、VCAM-1在妊娠期糖尿病發生、發展中的作用，及與妊娠期糖尿病病情嚴重程度的相關性，進而為妊娠期糖尿病的治療方案提供依據。

對象與方法

1.研究對象：選取2015年8月～2016年1月在筆者醫院產檢和住院分娩的妊娠期糖尿病孕婦50例為GDM組，診斷標準參照第8版《婦產科學》，妊娠期糖尿病的診斷標準：在妊娠24～28周行75g空腹葡萄糖耐量試驗，空腹血糖為5.1mmol/L，1h血糖為10.0mmol/L，2h血糖為8.5mmol/L，任意一點的血糖值達到或超過上述標準即可診斷為妊娠期糖尿病。另選取同期在筆者醫院產檢和住院的無妊娠合并癥和并發癥的正常孕婦50例為正常組。GDM組患者年齡21～35歲，平均年齡31.5±5.3歲，分娩孕周37.0～41.1周，平均孕周38.5±1.2周，正常組年齡21～35歲，平均年齡28.1±4.2歲，分娩孕周37.0～41.2周，平均孕周38.6±1.3周，均為單胎妊娠。所有研究對象均無妊娠期高血壓疾病、心臟病、嚴重肝、腎疾病，其他內分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史，無酗酒、抽煙和吸毒及應用胰島素等。

2.標本采集：入院后治療前抽取空腹靜脈血6ml，3ml用于測定血漿TNF-α、VCAM-1的濃度，另外3ml送筆者醫院生化檢驗室測定FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB。胎盤娩出后15min內收取胎盤母體面近臍帶根部直徑3cm范圍內的組織，約1cm3，進行沖洗、固定、脫水、石蠟包埋等。

3.檢驗指標：分別記錄兩組的一般資料，如年齡、分娩孕周、身高、體重、及血壓等，并測定兩組研究對象血中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平。采用ELISA測定血漿TNF-α、VCAM-1濃度；采用免疫組織化學技術檢測TNF-α、VCAM-1的表達并進行圖像分析；FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB等送筆者醫院生化檢驗室測定。

4.主要試劑:人TNF-α酶聯免疫試劑盒(中國武漢Elabscience公司)，人VCAM-1酶聯免疫試劑盒(中國武漢Elabscience公司)，鼠抗人TNF-α多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人VCAM-1多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

5.采用雙抗體夾心法：應用人TNF-α酶聯免疫試劑盒和人VCAM-1酶聯免疫試劑盒分別對TNF-α、VCA M-1的濃度進行測定(操作步驟按試劑盒說明書進行)。采用免疫組化法測定胎盤組織中TNF-α、VCAM-1的表達，在光學顯微鏡下觀察胎盤組織，陽性表達是細胞的胞質染色為深棕色顆粒，在鏡下選圖，Image-pro plus 6.0處理圖片，計算吸光度值。

結 果

1.一般資料比較:兩組患者的年齡、分娩孕周、身高、體重、收縮壓及舒張壓比較，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 一般情況比較

2.正常組各指標檢測結果:血漿TNF-α濃度平均值1.44±0.50ng/ml，血漿VCAM-1濃度平均值57.45±9.60ng/ml，FBG平均4.29±0.40mmol/L，HbA1c平均5.30%±0.30%，HDL平均2.08±0.40mmol/L，LDL平均2.96±0.50mmol/L，APOA平均2.15±0.30g/L，APOB平均1.18±0.20g/L(表2)。

3.GDM組各指標檢測結果：血漿TNF-α濃度平均值1.77±0.50ng/ml，血漿VCAM-1濃度平均值110.82±9.3ng/ml，FBG平均6.50±0.60mmol/L，HbA1c平均5.70%±0.40%，HDL平均1.60±0.30 mmol/L，APOA平均1.94±0.40g/L，LDL平均3.68±0.80mmol/L，APOB平均1.50±0.40g/L(表2)。

4.正常組和GDM組各指標間比較：GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、LDL、APOB的水平比正常組明顯升高(P<0.05)， HDL、APOA水平與正常組比較明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 正常組和GDM 組各指標間比較

與正常組比較，*P<0.05

5.血漿中各指標之間的相關性分析:GDM組血漿中TNF-α與VCAM-1濃度呈正相關(P<0.05)，TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c、LDL、APOB濃度呈正相關(P<0.05)，與HDL、APOA濃度呈負相關(P<0.05)。正常組血漿中TNF-α與VCAM-1的濃度無相關性(P>0.05)，TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA、APOB無相關性(P>0.05，表3)。

表3 血漿中各指標之間的相關性

6.免疫組化結果:TNF-α主要表達于胎盤絨毛滋養細胞和血管內皮細胞上，蛻膜細胞也有表達，定位于細胞質，染色為棕黃色顆粒(圖1)。TNF-α在正常組和GDM組的平均吸光度值分別為0.06±0.02、0.12±0.02，GDM組TNF-α的平均吸光度值明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。在GDM組血漿中TNF-α水平與胎盤中TNF-α平均吸光度值呈正相關(r=0.693，P<0.05)。VCAM-1主要表達于胎盤絨毛的合體滋養細胞和血管內皮細胞上，定位于細胞質，染色為棕黃色顆粒(圖2)。VCAM-1在正常組和GDM組的平均吸光度值分別為0.04±0.02，0.11±0.02，GDM組VCAM-1的平均吸光度值明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。在GDM組血漿中VCAM-1水平與胎盤中VCAM-1平均吸光度值呈正相關(r=0.617，P<0.05)。GDM組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值呈正相關(r=0.643，P<0.05)。

圖1 TNF-α在正常組和GDM組胎盤組織中的表達(SP，×400)A.正常組；B.GDM組

圖2 VCAM-1在正常組和GDM組胎盤組織中的表達(SP,×400)A.正常組；B.GDM組

討 論

妊娠期糖尿病是在妊娠期間首次發現，是最常見的妊娠并發癥之一，GDM可能導致孕婦及其后代產生各種不良后果，如妊娠高血壓、剖宮產、早產和巨大兒，以及代謝綜合征發展的傾向和2型糖尿病[6]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰島素抵抗和與亞臨床炎癥有關的血管內皮細胞功能障礙，胰島素是通過血管內皮細胞發揮作用，當血管內皮細胞受損時可引起胰島素抵抗，發生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管內皮細胞損傷在妊娠期糖尿病的發生、發展中起重要作用。

TNF-α是一種由中性粒細胞、單核巨噬細胞、NK細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及血管內皮細胞分泌的細胞因子。妊娠后胎盤組織也可分泌TNF-α。Tu′uhevaha等[3]在體外將TNF-α添加到原代人臍靜脈內皮細胞的實驗中發現TNF-α可誘導內皮細胞功能障礙。本研究結果表明妊娠期糖尿病患者血漿中TNF-α的濃度與正常組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。這說明TNF-α與妊娠期糖尿病的發病有關，筆者推測TNF-α引起血管內皮損傷后，導致胰島素抵抗，發生妊娠期糖尿病。同時本研究結果還表明妊娠期糖尿病患者的胎盤組織中TNF-α的表達與正常組比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且胎盤中TNF-α的表達與血漿TNF-α水平呈正相關。由此筆者推測胎盤組織中TNF-α表達升高可引起胎盤血管內皮損傷，造成胎盤功能障礙。這說明TNF-α可能通過損傷血管內皮細胞促進妊娠期糖尿病的發生、發展。

VCAM-1是免疫球蛋白基因超家族的成員，主要功能是介導淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞與血管內皮的黏附，它在白細胞-內皮細胞信號轉導中起重要作用。VCAM-1是內皮功能障礙的生物標志物[4]。VCAM-1可結合存在于白細胞上的配體，促進白細胞附著于血管內皮細胞，導致血管內皮細胞損傷[5]。研究表明VCAM-1在妊娠期糖尿病及糖尿病合并妊娠中均顯著高于正常組，這與本研究結果一致[7，8]。本研究結果顯示，正常組孕婦血漿中VCAM-1的濃度比GDM組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。這說明VCAM-1 與妊娠期糖尿病的發病密切相關，可以推測當VCAM-1損傷血管內皮后，引起胰島素抵抗，導致妊娠期糖尿病的發生。同時本研究結果還表明正常組孕婦胎盤組織中VCAM-1的表達比GDM組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，并且在GDM組中，胎盤中VCAM-1的表達與血漿VCAM-1的水平呈正相關，由此可以推測妊娠期糖尿病患者中高表達的VCAM-1可以損傷胎盤血管內皮細胞及滋養層細胞，造成胎盤功能障礙，進而引起胎兒缺血、缺氧，增加死胎的發生風險。這也說明了VCAM-1可能通過損傷血管內皮細胞促進妊娠期糖尿病的發生、發展。

Di Fulvio等[9]研究結果表明，在人臍靜脈內皮細胞內TNF-α能刺激ICAM-1、VCAM-1的表達，導致血管通透性增加和血管炎性反應，促進內皮細胞功能損傷，提示妊娠期糖尿病與炎性因子的過度表達和血管性白細胞黏附分子表達增高有關，兩者都可導致血管內皮功能障礙和血管疾病，加重胎盤的缺血、缺氧狀態。本研究結果表明，正常組血漿中TNF-α與VCAM-1的濃度無相關性(P>0.05)，而GDM組血漿中TNF-α與VCAM-1濃度呈正相關(P<0.05)；正常組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值無相關性(P>0.05)，而GDM組胎盤組織中TNF-α平均吸光度值與VCAM-1平均吸光度值呈正相關(P<0.05)。說明TNF-α作為炎性細胞因子，同時刺激VCAM-1的表達，兩者共同導致血管內皮細胞損傷，協同促進了妊娠期糖尿病的發生、發展。

本研究結果表明，GDM組血漿中FBG、HbA1c的濃度明顯高于正常組(P<0.05)，且GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c濃度呈明顯正相關(P<0.05)，而正常組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與FBG、HbA1c濃度無相關性(P>0.05)，說明TNF-α、VCAM-1在一定程度上反映了妊娠期糖尿病的嚴重程度。

妊娠期的脂質代謝異常與妊娠期糖尿病的發生有關，是導致不良妊娠結局的重要危險因素。HDL和LDL是脂代謝變化的指標，APOA是HDL的主要載脂蛋白，APOB是LDL的主要載脂蛋白。妊娠期相對較低的HDL與GDM和巨大兒發生顯著相關; 而相對較高的HDL是兩者的保護因素[10]。研究發現GDM組中LDL明顯高于對照組，HDL明顯低于對照組，研究還發現LDL亞型表型B與GDM風險增加4倍相關。Leiva等[11]研究發現孕婦血漿中LDL濃度隨孕周增加而升高，可能導致胎兒胎盤血管內皮功能的改變。本實驗中GDM組血漿中LDL、APOB的濃度水平與正常組比較明顯升高(P<0.05)， HDL、APOA濃度水平與正常組比較明顯降低(P<0.05)，且GDM組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與LDL、APOB濃度呈正相關(P<0.05)，與HDL、APOA濃度呈負相關(P<0.05)，而正常組血漿中TNF-α、VCAM-1分別與HDL、LDL、APOA和APOB沒有相關性(P>0.05)。

綜上所述，通過監測妊娠期糖尿病患者血漿和胎盤組織中TNF-α、VCAM-1的表達，結合FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平，評估妊娠期糖尿病病情的嚴重程度和胎兒宮內環境，為胎兒胎盤血管內皮功能障礙提供治療方案，改善不良妊娠結局及降低孕產婦和圍生兒代謝疾病發生的風險。