結直腸癌Ang-2和CD147的水平及其對預后的預測價值

叢玲華 鐘國平 陳 鯀 方來福 李 萍

手術及術后輔助化療是結直腸癌患者的主要治療方式，手術標本的病理檢查及病理相關指標檢測在結直腸癌患者的預后評估中有重要地位[1]。研究表明，Ang-2是一種新型的血管生成調節劑，在腫瘤血管生成中起著至關重要的作用，CD147通過調節腫瘤細胞與間質相互作用參與腫瘤的發生、發展和侵襲轉移[2，3]。這兩種標志物在腫瘤中的表達模式對腫瘤患者的預后可能有重要提示作用。為此，筆者醫院通過組織芯片技術對260例結直腸癌患者進行研究，旨在探討Ang-2和CD147在人結直腸癌中的表達水平及其對預后的預測價值，現報道如下。

資料與方法

1.臨床資料:回顧性分析2012年6月～2016年5月筆者醫院診治的結直腸癌患者，納入標準：①臨床及病理檢查符合《中國結直腸癌診療規范(2017版)》中結直腸癌的診斷；②均于筆者醫院行結直腸癌根治術治療及術后輔助化療；③新發患者，無前期治療干擾。排除標準：①無法耐受相關治療而中途終止治療的患者；②患者依從性較差，無法配合隨訪工作[4]。共納入260例患者，其中，男性139例，女性121例，患者年齡58～75歲，平均年齡66.40±8.50歲，結腸癌113例，直腸癌147例。根據12個月內的預后情況，將結直腸癌患者分為生存組(215例)和死亡組(45例)，并選擇50例結直腸息肉患者作為對照組，男性28例，女性22例，平均年齡65.63±8.91歲，結腸息肉43例，直腸息肉7例。

2.治療方案：參照《中國結直腸癌診療規范(2017版)》指南，預后分期為臨床Ⅰ期的患者行單純手術治療，臨床Ⅱ～Ⅳ期期患者手術后分別聯合單純氟尿嘧啶類、5氟尿嘧啶為基礎的鉑類及鉑類化療聯合貝伐珠單克隆抗體等靶向治療[4]。

3.研究方法：通過組織芯片技術及免疫組化方法檢測結直腸癌患者及對照組的Ang-2蛋白和CD 147蛋白表達水平。(1)組織芯片制備：由高年資病理醫師重判每例的HE切片，在結直腸癌病例的癌組織、結腸息肉的息肉組織和兩者周圍正常組織各取3個區域，取樣針直徑1.5mm，設計7×6點陣，共42位點，組織芯間距3.0mm。52℃恒溫烤箱融蠟，4℃冰箱存放備用。(2)免疫組化檢查：采用組織芯片系統(Quick-Ray,UT06,韓國UNITMA公司)進行分析。組織芯片切片經二甲苯脫蠟、乙醇脫二甲苯、水化。檸檬酸緩沖液(pH值為6.0)加熱至98℃12 min行抗原修復，分別滴加一抗Ang-2抗體(EPR2891, 美國Abcam公司)和CD147抗體(ab78106,美國Abcam公司)，二抗為通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育30min。染色情況由2名高年資病理病理醫師分別評估。兩種蛋白的表達模式為：Ang-2蛋白表達于細胞質，CD147蛋白表達于細胞膜。染色強度分值如下：0分(無染色)、1分(≤20%的腫瘤細胞出現微弱或中等陽性)、2分(>20%的腫瘤細胞出現微弱或中等陽性或<70%的腫瘤細胞出現完全陽性)、3分(≥70%腫瘤細胞出現中等或完全陽性)。陽性細胞百分比分值為：0分(無細胞陽性)、1分(<25%細胞陽性)、2分(25%～75%細胞陽性)和3分(>75%細胞陽性)，著色腫瘤細胞≥1%定義為陽性。最終染色評分由強度分值和陽性細胞百分比分值相乘而來。

4.評價指標：比較結直腸癌組與對照組患者的一般資料、Ang-2及CD147的表達差異，不同預后結直腸癌患者的一般資料、臨床病理資料及Ang-2及CD147的表達差異，并比較Ang-2及CD147預測結直腸癌患者預后的診斷效能(包括診斷準確率、敏感度、特異性、陽性預測值和陰性預測值等)。準確率=診斷符合人數/總例數×100%，敏感度=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%，特異性=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%，陽性預測值=真陽性人數/(真陽性人數+假陽性人數)×100%，陰性預測值=真陰性人數/(真陰性人數+假陰性人數)×100%。

5.隨訪：根據病案信息每3個月對患者進行一次隨訪，終點事件為全因死亡。隨訪時間為12個月，隨訪截止于2017年5月。

結 果

1.一般資料:結直腸癌組與對照組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.結直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達：結直腸癌組患者Ang-2及CD147表達水平明顯高于對照組(P=0.000)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1及表2。

表1 結直腸癌組與對照組一般資料的比較

圖1 結直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達情況A.結直腸癌組中腫瘤組織高表達Ang-2蛋白 (EnVision法，×100)；B.對照組中息肉組織低表達Ang-2蛋白(EnVision法，×100);C.結直腸癌中腫瘤組織高表達CD147蛋白(EnVision法，×200)；D.對照組中息肉組織低表達CD147蛋白(EnVision法，×200)

3.不同預后的結直腸癌患者一般資料的比較：生存組與死亡組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 結直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達情況

表3 不同預后的結直腸癌患者一般資料的比較

4.不同預后的結直腸癌患者臨床及病理資料的比較：生存組與死亡組患者的腫瘤部位、病理類型、分化程度、臨床分期及治療方式等資料間比較差異無統計學意義(P>0.05)。生存組Ang-2及CD147表達分值明顯低于死亡組(P=0.000)，淋巴結轉移情況明顯低于死亡組(P=0.000)，詳見表4。

5.結直腸癌組織Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的ROC曲線:ROC曲線顯示，應用Ang-2及CD147表達水平對預測結直腸癌患者預后具有較高的診斷效能，其AUC分別為0.821和0.788，差異無統計學意義(P>0.05)；Youden指數提示Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的最佳截點分別為≥4分和≥3分，詳見圖2和表5。

6.Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的診斷效能:應用ROC曲線所得出的最佳截點，Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的診斷準確率(81.88%，83.33%)、敏感度(81.30%，82.00%)、特異性(83.33%，87.69%)和陽性預測值(87.23%，89.23%)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表6。

討 論

結直腸癌發生率逐漸上升，發病年齡日趨年輕化，嚴重威脅人類健康[5]。雖然手術切除是治療結直腸癌的主要方式，但患者術后的預后千差萬別[6]。因此，尋找對腫瘤患者預后有意義的檢測指標對預測結直腸癌患者預后及采取治療措施迫切需要。隨著病理技術的飛速發展，病理檢測在腫瘤患者的治療方式選擇和預后評估中占據著越來越重要的位置，通過病理學技術進行腫瘤標志物的檢測成為臨床醫生關注病情發展、采取治療措施必不可少的組成部分[7]。尤其是組織芯片技術的開展，使得病理工作及科學研究得以大規模、標準化開展，為腫瘤相關標志物的研究提供了高效可行的技術平臺。

表4 不同預后的結直腸癌者臨床及病理資料的比較

圖2 Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的ROC曲線

表5 Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的曲線下面積

指標最佳截點AUC標準誤差95% CIAng-240.8210.05650.712～0.903CD14730.7880.06960.674～0.877

表6 Ang-2及CD147表達水平預測結直腸癌患者預后的診斷效能(%)

Ang-2是繼血管內皮生長因子之后發現的一種新的促血管生成因子，它具有內皮細胞特異性，能夠調節血管生成，在腫瘤血管形成中起到重要調節作用，不僅能夠為腫瘤細胞提供快速生長所需的充足營養，還通過刺激相關細胞因子釋放促進腫瘤細胞的增殖和生長，在腫瘤進展和不良預后中有重要促進作用[8，9]。CD147是一類細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)，通過刺激基質金屬蛋白酶(MMPs)的生成進而增加細胞外基質和基膜的降解，為腫瘤的侵襲和轉移提供充分條件[10，11]。可見，這兩種標志物在腫瘤患者疾病進展和不良預后中都有重要的促進作用。

本研究通過對2012～2016年260例結直腸癌患者進行回顧性分析，結果顯示，結直腸癌組與對照組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間差異無統計學意義，但結直腸癌組患者Ang-2及CD147的表達水平明顯高于對照組，提示結直腸癌具有較高的Ang-2及CD147表達水平。腫瘤細胞增殖和轉移的一個重要條件是腫瘤血管形成，Ang-2破壞內皮細胞和周圍基質，增加不穩定狀態的血管內皮和基質對生長因子的敏感度，誘導血管再建和腫瘤血管生成，為腫瘤細胞增殖提供保障[12，13]。細胞外基質對腫瘤細胞的遷移有阻礙作用，CD147通過MMPs，尤其是MMP-2降解細胞外基質，減少腫瘤侵襲和轉移的天然阻力[14]。由于Ang-2和CD147兩種標志物都在腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移中扮演重要角色，因此在結直腸癌中的表達水平明顯增高。Ismail等[3]和Hyungjoo[1]分別研究了CD147和Ang-2在結直腸癌患者中的表達情況，發現這兩種標志物在結直腸癌患者中明顯增加，與本研究結論一致。

此外，生存組與死亡組患者的一般資料(年齡、性別、BMI和既往史)及腫瘤部位、病理類型、分化程度、臨床分期及治療方式等資料間比較，差異無統計學意義，但生存組Ang-2及CD147表達分值明顯低于死亡組，淋巴結轉移情況明顯低于死亡組，提示Ang-2及CD147在不良預后患者中表達明顯增加，淋巴結轉移在不良預后患者中明顯增多。同時，ROC曲線顯示，應用Ang-2及CD147表達水平對預測結直腸癌患者不良預后具有較高的診斷效能，最佳截點分別為≥4分和≥3分，但Ang-2及CD147的診斷準確率、敏感度、特異性和陽性預測值比較差異無統計學意義。其原因為Ang-2的主要作用是促進腫瘤血管生成，新生的腫瘤血管不僅是腫瘤細胞增殖所必需的內部條件，也是腫瘤侵襲和轉移的第一路徑[15, 16]。CD147主要通過活化 MMP-2降解基膜和細胞外間質，促進腫瘤的侵襲和轉移，而MMP-2在發揮作用過程中，還可以釋放促血管生成因子，尤其是血管內皮生長因子(VEGF)，從而促進新生血管形成，與Ang-2具有協同作用。同時，淋巴結轉移為腫瘤細胞的全身播散提供了必要的途徑，是腫瘤患者病情進展的標志之一，通過Ang-2的促腫瘤血管生成及CD147的細胞外間質講解作用，腫瘤細胞獲得更多侵襲血管和淋巴管的機會，大大增加了淋巴結的轉移機會。因此，Ang-2、CD147及淋巴結轉移三者在結直腸癌演變和進展中即各自發揮特定作用，又在時間和空間上相互配合，協同促進細胞癌變的發生、發展和侵襲轉移。這與Salem等[17]和Farahani等[18]的研究結果一致。但由于本研究的免疫組化結果采用半定量分析方法，有一定主觀性，其準確度、敏感度和特異性尚存在一定誤差，因此有待于進一步研究。

綜上所述，結直腸癌患者Ang-2和CD147表達水平較高，Ang-2和CD147在預測結直腸癌患者預后中有較高價值，Ang-2≥4分和CD147≥3分可作為提示不良預后的參考指標。