白藜蘆醇對(duì)化療所致大鼠卵巢損傷的保護(hù)作用

朱小丹 董若曦 陳 燕 吳曉慧 姚馨怡 許文娟 樊伯珍

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)指女性在40歲之前卵巢功能衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂(如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，是一種較為嚴(yán)重的威脅生殖健康的疾病。近年來(lái)，隨著化學(xué)治療藥物的廣泛使用，化療導(dǎo)致的卵巢損傷成為POI的重要病因。目前對(duì)于化療性卵巢損傷的保護(hù)，所探索的各種藥物和方法均存在一定的局限性。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種存在于葡萄、花生根莖和多種藥用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有較強(qiáng)大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚、防止人體低密度脂蛋白氧化、清除自由基，并能改善修復(fù)卵母細(xì)胞損傷，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，減輕氧化損傷所致老化和與年齡相關(guān)的疾病[1]。本研究旨在探討白藜蘆醇預(yù)防性應(yīng)用對(duì)化療后卵巢組織結(jié)構(gòu)、各級(jí)卵泡數(shù)量、內(nèi)分泌功能所起的一系列作用，為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應(yīng)用大劑量的化療藥物時(shí)所導(dǎo)致的卵巢損傷，提供有效的保護(hù)方法和科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:近交系雌性Wistar大白鼠，8周齡。體質(zhì)量180～200g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。喂食無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)鼠飼料及凈化水，室溫20～25℃，相對(duì)濕度45%～55%。每日光照12h，飼養(yǎng)1周熟悉環(huán)境后，每日清晨9:00行陰道涂片，顯微鏡下觀察動(dòng)情周期，選用有正常動(dòng)情周期的40只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：順鉑凍干粉購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司；白藜蘆醇購(gòu)自上海祥弘生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫法E2、FSH、AMH試劑盒均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)分組及處理：40只雌性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、腹腔化療組(CP模型組)、低劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(低Res組)、高劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(高Res組)，每組10只大鼠。在21天的實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組不給于任何藥物處理，CP模型組給予生理鹽水1ml/d灌胃，低Res組、高Res組則分別給予白藜蘆醇25mg/(kg·d)、75mg/(kg·d)溶于生理鹽水1ml中灌胃。在實(shí)驗(yàn)第15天，除對(duì)照組外，其余3組大鼠均稱(chēng)質(zhì)量后，單次給予順鉑(5mg/kg)，用生理鹽水稀釋至2ml，注射入腹腔內(nèi)。

4.標(biāo)本提取及檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)第21天，即順鉑腹腔注射后1周，各組大鼠完成全部給藥后24h，對(duì)所有大鼠進(jìn)行麻醉。取腹主動(dòng)脈血，于室溫下靜置2h后，3000r/min離心15min。按照酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定血清E2、FSH、AMH濃度。處死各組大鼠，取出雙側(cè)卵巢稱(chēng)。卵巢組織脫水后，10%甲醛固定24h，經(jīng)過(guò)常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片厚度5μm，每隔9張即取第10張切片，用蘇木精和伊紅染色。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察卵泡發(fā)育，進(jìn)行各級(jí)卵泡計(jì)數(shù):原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡(初級(jí)泡數(shù)+次級(jí)卵泡)、成熟卵泡數(shù)量。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清激素水平的變化:各組大鼠血清中E2和FSH濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，CP模型組大鼠血清AMH濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組大鼠血清AMH濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而低Res組和高Res組比較，血清AMH濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、AMH濃度

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

2.各組大鼠卵巢濕質(zhì)量的變化：取材后稱(chēng)量大鼠卵巢濕質(zhì)量，與對(duì)照組比較，CP模型組大鼠卵巢濕質(zhì)量減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CP模型組比較，高Res組、低Res組大鼠卵巢濕質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而高Res組、低Res組比較，大鼠卵巢濕質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠卵巢濕質(zhì)量

與對(duì)照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

3.各組大鼠卵泡數(shù)目的變化:與對(duì)照組比較，CP模型組大鼠原始、生長(zhǎng)、成熟卵泡的數(shù)量均明顯減少(P<0.05)。與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組各級(jí)卵泡數(shù)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低Res組與高Res組比較，各級(jí)卵泡數(shù)量增多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖1、表3。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)白藜蘆醇的治療，大鼠血清AMH表達(dá)水平的升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)檢查顯示，白藜蘆醇能通過(guò)保護(hù)原始、生長(zhǎng)和成熟卵泡，來(lái)減少順鉑誘導(dǎo)的卵巢損傷。

圖1 各組大鼠卵巢中的各期卵泡(HE，×200)A.對(duì)照組；B.CP模型組；C.低Res組；E.高Res組。原始卵泡；生長(zhǎng)卵泡；成熟卵泡

表3 各組大鼠卵巢內(nèi)各期卵泡數(shù)

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CP模型組比較，#P<0.05

近年來(lái)，隨著化療藥物和靶向治療的進(jìn)展，腫瘤和免疫性疾病的緩解和治愈率正在穩(wěn)步提高。但化療可能導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備下降，甚至完全性卵巢功能衰竭。順鉑是一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，用于治療大多數(shù)類(lèi)型的癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可促使人卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡和原始卵泡的破壞，可導(dǎo)致以卵泡細(xì)胞凋亡增加、AMH分泌減少、動(dòng)情周期紊亂等為特征的卵巢衰竭[2，3]。在化療引起的卵巢損傷中，可通過(guò)測(cè)定激素如促卵泡激素(FSH)，雌二醇(E2)，抑制素B(inhibit B)和抗苗勒試管激素(AMH)的血漿水平來(lái)評(píng)估藥物的保護(hù)作用[4]。

AMH是一種由小發(fā)育卵泡產(chǎn)生的二聚體蛋白質(zhì)，血漿AMH水平不隨月經(jīng)周期而改變。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，AMH水平下降，與卵巢儲(chǔ)備能力呈正相關(guān)。相比其他激素，這是一個(gè)更為敏感的卵巢儲(chǔ)備指標(biāo)[5]。Yeh等[6]評(píng)估血清AMH和FSH水平、卵巢AMH的表達(dá)和卵泡的形態(tài)(一級(jí)、二級(jí)和竇卵泡)作為生物標(biāo)志物在順鉑誘導(dǎo)卵巢損傷中的變化，結(jié)果表明AMH在血清及卵巢組織中的表達(dá)呈順鉑劑量依賴(lài)式降低，這種減少的基本機(jī)制和卵泡凋亡的增加有關(guān)。Erba等[7]研究了催產(chǎn)素對(duì)順鉑損傷的卵巢組織的治療作用，確定了順鉑導(dǎo)致大鼠血清AMH水平顯著降低。所以，血清AMH水平可作為順鉑誘導(dǎo)卵巢損傷的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射順鉑5mg/kg可顯著減少原始、初級(jí)和次級(jí)卵泡的數(shù)目，降低血清AMH的水平，證實(shí)了順鉑化療對(duì)卵泡細(xì)胞有毒性作用。Erba等[7]在順鉑治療大鼠中也發(fā)現(xiàn)了原始卵泡數(shù)目明顯下降，并在組織病理學(xué)評(píng)估卵泡，發(fā)現(xiàn)順鉑治療損傷大多數(shù)卵泡顆粒層，降低卵泡的完整性，與本研究結(jié)果一致。但本研究中各組大鼠E2和FSH的監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能和大鼠的動(dòng)情周期，以及E2、FSH的脈沖釋放有關(guān)。

白藜蘆醇是一種多酚類(lèi)，非類(lèi)黃酮類(lèi)抗氧化劑。它是在葡萄皮和高劑量紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的植物抗毒素[8]。它具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能，也對(duì)自由基具有直接的破壞作用[9]。Rubiolo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用25mg、50mg和75mg劑量的白藜蘆醇可活化抗氧化酶活性，保護(hù)受氧化應(yīng)激損傷的原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞免受氧化損傷，50mg組的保護(hù)效應(yīng)最顯著。Liu等[11]在一項(xiàng)白藜蘆醇對(duì)大鼠年齡相關(guān)不孕癥的影響的研究中，將白藜蘆醇30mg/L[約7mg/(kg·d)]加入飲用水中6和12個(gè)月，并在白藜蘆醇和對(duì)照組中評(píng)估卵巢功能和生育力，結(jié)果表明，白藜蘆醇能保護(hù)免受年齡相關(guān)的生育力變化，促進(jìn)卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的恢復(fù)，并保持了健康的卵泡數(shù)量。這些研究發(fā)現(xiàn)支持白藜蘆醇延緩卵巢衰老的假說(shuō)。

白藜蘆醇的這些作用可能與端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性增加，與生殖細(xì)胞功能障礙減少和SIRT1激活有關(guān)。Kong等[12]研究了白藜蘆醇的作用對(duì)不同年齡大鼠卵巢發(fā)育的影響，20mg/(kg·d)的白藜蘆醇處理顯著增加卵母細(xì)胞總數(shù)，閉鎖卵泡數(shù)目減少，并抑制了細(xì)胞凋亡以及卵泡從原始階段向其他階段的轉(zhuǎn)變階段。Chen等[13]研究了影響中藥多酚對(duì)衰老大鼠卵巢儲(chǔ)備的保護(hù)作用，并顯示已經(jīng)用白藜蘆醇治療的老鼠4個(gè)月有更健康的卵泡和更少的閉鎖卵泡。Atli等[14]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療增加了大鼠發(fā)育卵泡，減少閉鎖卵泡的數(shù)量，并保護(hù)卵巢功能抵抗氧化損傷。在本研究中，低Res組給予25mg/kg，高Res組給予75mg/kg白藜蘆醇共21天，第15天給予單次劑量5mg/kg 順鉑腹腔內(nèi)注射。低劑量和高劑量白藜蘆醇組的AMH水平均較順鉑模型組顯著升高。組織學(xué)病理發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量白藜蘆醇組的原始、生長(zhǎng)、成熟卵泡均比順鉑組高。

Simsek等[15]研究了白藜蘆醇對(duì)全身放射治療引起的大鼠急性卵巢毒性的療效，并表明在照射前施用生理劑量白藜蘆醇(10mg/kg)的總卵泡數(shù)量比對(duì)藥物劑量(100mg/kg)具有更大的保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為與高劑量白藜蘆醇的促凋亡作用有關(guān)。Tseng等[16]報(bào)道，100mg/kg劑量的白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠大腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。同樣，Chao等[17]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對(duì)人垂體瘤GH3細(xì)胞具有濃度依賴(lài)性雙相作用，并且表明在較低劑量(1μmol/L)下，白藜蘆醇增加細(xì)胞增殖，而在10μmol/L或更高劑量下，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中低劑量白藜蘆醇組各級(jí)卵泡數(shù)量明顯比順鉑模型組較高。但高劑量白藜蘆醇組的原始、生長(zhǎng)、成熟卵泡數(shù)量并沒(méi)有明顯低于低劑量白藜蘆醇組，這些結(jié)果可以通過(guò)白藜蘆醇的濃度依賴(lài)性雙相效應(yīng)來(lái)解釋。這項(xiàng)研究表明，適當(dāng)劑量的白藜蘆醇可能通過(guò)增加健康卵泡的數(shù)量來(lái)保護(hù)卵巢功能。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，順鉑腹腔化療會(huì)破壞大鼠卵巢結(jié)構(gòu)，顯著降低卵巢原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡的數(shù)目，降低血清AMH的濃度水平。而白藜蘆醇，特別是低劑量白藜蘆醇的預(yù)防性使用，能夠減輕順鉑對(duì)大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)的破壞及其對(duì)卵泡生長(zhǎng)過(guò)程的抑制作用，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，增加各級(jí)卵泡數(shù)，增強(qiáng)卵巢的儲(chǔ)備能力，其具體的保護(hù)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。