急性淋巴細胞白血病患兒血清miR-17、miR-29c的表達及臨床意義

趙麗穎 李慧霞 張紅梅

急性白血病(acute leukemia，AL)是造血系統的惡性克隆性疾病，可分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)，ALL常見于兒童，是兒童最常見的惡性腫瘤[1]。ALL病因復雜尚未完全清楚，近年來隨著聯合化療技術和造血干細胞移植技術發展應用，兒童ALL誘導緩解率大大提高，存活率顯著改善，但仍有20%左右緩解患兒發生中樞神經系統、骨髓等復發，威脅患兒生命健康[2]。因此，進一步探究ALL的發病機制，發掘新的預后標志物和治療靶點非常關鍵。miRNA作為一類小的非編碼RNA調控轉錄后基因表達，在白血病發生、發展及預后中發揮重要作用[3]。研究表明，miRNAs在造血干細胞自我更新、衰老及向惡性肝細胞轉變等過程中參與調控細胞信號轉導途徑及表觀遺傳機制，是白血病干細胞的重要調控因子[4]。本研究通過檢測ALL患兒血清中miR-17、miR-29c表達水平，分析miR-17、miR-29c表達與患兒臨床指標及預后的關系，旨在探討miR-17、miR-29c在ALL進展中的臨床意義。

資料與方法

1.一般資料:選擇2010年9月～2013年2月在筆者醫院初診為ALL并住院治療的43例患兒作為研究對象，其中男性26例，女性17例，患兒年齡1～14歲，平均年齡5.69±1.24歲。納入標準：①經臨床病理特征、細胞學、形態學、免疫學等檢查符合《WHO造血與淋巴組織腫瘤分類(2016)》中急性白血病分類及診斷標準[5]；②均為初診，患兒家屬知情并簽署同意書；③臨床資料完整便于預后判斷；④經醫院倫理學委員會批準。排除標準：①確診前未進行相關治療；②合并其他組織惡性腫瘤；③合并嚴重慢性消耗性疾??；④依從性差及不方便隨訪；⑤合并全身其他疾病患者。另選同時期體檢健康兒童40例作為對照組，其中男性22例，女性18例，年齡1～15歲，平均年齡6.14±1.37歲。兩組兒童性別、年齡等一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

2.治療方法：患兒全身化療采用CCLG-2008方案，化療分為誘導緩解、早期強化、鞏固治療、延遲強化、維持治療5個階段。療效標準：①誘導緩解：誘導化療35天，患兒貧血、出血等臨床癥狀消失，白細胞(white blood cell，WBC)計數和血小板計數恢復正常，紅細胞系及巨核細胞系正常，骨髓中早幼粒細胞及原粒細胞之和≤5%；②復發：誘導緩解后，骨髓中早幼粒細胞+原粒細胞>20%，或骨髓外、腦脊液中發現白血病細胞浸潤。每例患兒隨訪0～5年。

3.觀察指標:所有ALL患兒在入院當日抽取肘靜脈血4ml，對照組兒童體檢當日抽取肘靜脈血4ml。采用試劑盒法提取血清總RNA，經反轉錄后，以U6為內參，RT-PCR檢測兩組兒童血清中miR-17、miR-29c相對表達量。實驗用RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司，操作方法嚴格按照說明書進行。

結 果

1.兩組血清miR-17、miR-29c表達水平:病例組兒童血清中miR-17相對表達量高于對照組，miR-29c相對表達量低于對照組，兩組兒童血清中miR-17、miR-29c相對表達量比較,差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1和圖1。

表1 兩組兒童血清miR-17、miR-29c表達水平

圖1 兩組兒童血清miR-17、miR-29c相對表達量A.miR-17;B.miR-29

2.miR-17、miR-29c與ALL患兒臨床指標的關系:初診WBC計數≥50×109/L患兒血清中miR-17表達水平顯著高于初診WBC計數<50×109/L患兒(P<0.05)，miR-29c表達水平顯著低于初診WBC計數<50×109/L患兒(P<0.05)；B-ALL患兒血清中miR-17表達水平顯著低于T-ALL患兒(P<0.05)，miR-29c表達水平顯著高于T-ALL患兒(P<0.05)；潑尼松誘導敏感患兒血清miR-29c表達水平顯著高于不敏感患兒(P<0.05)；患兒血清miR-17表達水平與性別、年齡、染色體異常及潑尼松誘導敏感度無關(P>0.05)，miR-29c表達水平與性別、年齡、染色體異常無關(P>0.05),詳見表2。

表2 miR-17、miR-29c與ALL患兒臨床指標的關系

3.不同預后患兒血清miR-17、miR-29c表達水平:ALL患兒治療過程中死亡4例，治療后，誘導緩解39例，誘導緩解率90.70%，其中復發17例，復發率43.58%。誘導緩解后死亡8例，生存31例，5年總生存率72.09%，其中無事件生存22例，無事件生存率51.16%。生存組患兒血清miR-17相對表達量顯著低于死亡組患兒(P<0.05)，miR-29c相對表達量顯著高于死亡組患兒(P<0.05),詳見表3和圖2。

表3 不同預后患兒血清miR-17、miR-29c表達水平

圖2 不同預后患兒血清miR-17、miR-29c相對表達量

4.血清miR-17、miR-29c與患兒生存率的關系:根據患兒血清miR-17表達中位值2.45，將43例患兒分為兩組：miR-17高表達組(≥2.45)20例，miR-17低表達組(<2.45)23例。miR-17高表達組患兒5年無事件生存率30%顯著低于miR-17低表達組患兒69.57%(P<0.05)，5年總生存率55%顯著低于miR-17低表達組患兒86.96%(P<0.05)；根據患兒血清miR-29c表達中位值1.25，將患兒分為兩組：miR-29c高表達組(≥1.25)19例，miR-29c低表達組(<1.25)24例。miR-29c高表達組患兒5年無事件生存率73.68%顯著高于miR-29c低表達組患兒33.33%(P<0.05)，5年總生存率94.74%顯著高于miR-29c低表達組患兒54.17%(P<0.05),詳見表4和圖3、圖4。

表4 血清miR-17、miR-29c與患兒生存率的關系[n(%)]

圖3 ALL患兒5年無事件生存率K-M分析

圖4 ALL患兒5年總生存率K-M分析A.miR-17;B.miR-29c

討 論

AL發病時骨髓中原始細胞及幼稚細胞異常大量增殖，在骨髓中積聚抑制正常造血，并浸潤脾、淋巴結、肝臟等骨髓外臟器，臨床表現為貧血、浸潤、出血、感染等癥狀[6]。80%以上的AL兒童屬于ALL，近年來，ALL患兒生存率得到很大提高，張鈺等[7]采用CCLG-ALL-2008方案治療ALL患兒，結果誘導緩解率96.3%，5年總生存率84.72%，5年無事件生存率81.53%。本研究采用CCLG-2008方案治療ALL患兒，誘導緩解率90.70%，5年總生存率72.09%，無事件生存率51.16%，低于張鈺等[7]研究結果，可能受樣本量、患兒嚴重程度、復發等因素影響。研究表明，多種miRNAs影響造血細胞發育、分化，與白血病、淋巴瘤的發生及發展有關，此外，miRNAs異常表達可導致抑癌基因或致癌基因轉錄后調控失常，導致白血病發生[8]。

miR-17由miR-17-92編碼，在血液系統腫瘤、胃癌、肺癌等多種腫瘤中過表達，發揮促癌作用。Shi等[9]研究表明，miR-17-92在難治性ALL中過表達，可能與患者多重抗藥性發生、發展有關。Sharifi等[10]研究表明，抑制miR-17-92可通過調控p63的表達，誘導人急性早幼粒細胞白血病細胞凋亡并抑制細胞增殖，提示抑制miR-17-92可作為治療白血病的新靶點。本研究結果表明，ALL患兒血清中miR-17相對表達量顯著升高，與患兒初診WBC計數、免疫分型有關。兒童ALL預后相關因素研究表明，初診WBC計數≥50×109/L、潑尼松實驗敏感度是導致患兒預后不良的獨立危險因素[11]。說明血清miR-17表達水平可能與患兒預后不良有關。進一步分析死亡患兒和生存患兒血清miR-17表達水平發現，死亡患兒血清中miR-17表達水平顯著高于生存患兒，K-M生存曲線分析顯示，miR-17高表達患兒5年無事件生存率和總生存率均顯著低于miR-17低表達患兒，證實miR-17高表達患兒預后較差。相關機制研究表明，BCR-ABL陽性ALL患者中抗凋亡蛋白BCL2是miR-17的直接靶點，體外實驗證實，BCL2抑制可作為改善BCR-ABL陽性ALL患者治愈性治療或長期疾病控制的新措施[12]。Mian等[13]研究表明，混合譜系白血病(MLL)中miR-17-92簇高表達，通過抗miR-17-92治療顯著降低MLL融合細胞系的集落形成能力，并證實PKNOX1是miR-17-92的作用靶點，提示miR-17-92在MEIS1/HOXA961介導的白血病細胞發育中發揮調控作用，可被用作新的治療靶點。

miR-29c是miR-29家族成員之一，先前研究表明miR-29c是AML和骨髓分化的調控因子，在白血病中起腫瘤抑制劑作用。Gong等[14]研究表明，AML外周血單核細胞中miR-29表達降低，與信號分子Akt2、CCND2和c-Myc水平增加有關，動物實驗表明，對AML小鼠注射miR-29c、miR-29a能夠明顯緩解白血病癥狀，提示挽救miR-29家族表達可能為AML治療提供新策略。但miR-29c在兒童ALL中是否有相同的表達及意義尚未見報道。本研究結果，ALL患兒血清miR-29c相對表達量顯著降低，與初診WBC計數、免疫分型及潑尼松實驗敏感度有關，進一步分析表明，死亡患兒血清miR-29c表達水平顯著低于生存患兒，K-M生存曲線分析顯示，miR-29c低表達患兒5年無事件生存率和總生存率均顯著低于miR-29c高表達患兒，說明miR-29c在ALL患兒中低表達與患兒不良預后有關。

綜上所述，miR-17和miR-29c在ALL患兒血清中異常表達，與患兒初診WBC計數、免疫分型及潑尼松實驗敏感度等臨床指標有關，可能參與ALL發生、發展過程，對患兒預后產生不良影響。本研究初步說明miR-17和miR-29c可作為ALL患兒的預后標志物，提示miR-17和miR-29c可作為ALL患兒臨床治療的新靶點。今后會繼續擴大樣本量，探究miR-17和miR-29c在小兒ALL中的調控機制。