太白山藤梨根提取物對(duì)人喉癌細(xì)胞HeP—2生長(zhǎng)抑制作用分析

郭潔 張曉雙 劉繼平

[摘要] 目的 探討太白山藤梨根提取物對(duì)人喉癌細(xì)胞HeP-2的生長(zhǎng)抑制作用。 方法 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)人喉癌細(xì)胞HeP-2的增殖率，采用MTT（四甲基噻唑藍(lán)）法測(cè)定太白山藤梨根提取物對(duì)HeP-2細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線、時(shí)間-效應(yīng)曲線。采用Real-time PCR檢測(cè)太白山藤梨根提取物作用HeP-2細(xì)胞后，COX-2、P65、VEGF mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 太白山藤梨根提取物作用于HeP-2細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞存活的百分率呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性。太白山藤梨根提取物各濃度作用時(shí)間在12、24、48、72、96、120 h時(shí)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢(shì)。太白山藤梨根提取物作用HeP-2細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)均受到不同程度的抑制。各作用時(shí)間的COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 太白山藤梨根提取物能夠抑制人喉癌細(xì)胞HeP-2的增殖，這種抑制作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性，其抑制作用可能與下調(diào)COX-2、P65、VEGF的表達(dá)密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 藤梨根提取物；喉癌；環(huán)氧化酶-2；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）03（b）-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of Taibaishan vine root extract on the growth of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2. Methods The proliferation rate of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2 was counted by cell counting method. The dose-effect curve and time-effect curve of Hep-2 cells in Taibaishan vine root extract were determined by MTT （tetramethylthiazolyl blue） method. The expression of COX-2， P65 and VEGF mRNA was detected by Real-time PCR after detection of Hep-2 cells in Taibaishan Fujisui root extract. Results After the extract of Taibaishan vine root extract was applied to HeP-2 cells， the percentage of HeP-2 cells surviving decreased with the increase of drug concentration， showing a significant concentration-dependent. At the 12， 24， 48， 72， 96 h， and 120 h， the concentration of the extract of Taibaishan vine root extract showed obvious dose-dependency and time-dependent relationship. With the prolongation of the action time and the increase of drug concentration， and the survival rate of HeP-2 cells showed a significant downward trend. After treatment with HeP-2 cells， the expression of COX-2 mRNA， P65 mRNA and VEGF mRNA were inhibited in different degrees. The expressions of COX-2 mRNA， P65 mRNA and VEGF mRNA were significantly different （P<0.01）. Conclusion The extract of Taibaishan vine root can inhibit the proliferation of human laryngeal carcinoma cell line HeP-2. The inhibition is dose-dependent and time-dependent， which may be closely related to the down-regulation of COX-2， P65 and VEGF expression.

[Key words] Vine root extract； Laryngeal carcinoma； Cyclooxygenase-2； Vascular endothelial growth factor

喉癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，隨著生活環(huán)境的變化和生活方式的轉(zhuǎn)變，喉癌的發(fā)病率有逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。臨床上治療喉癌常采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療的方法，但耐藥性、治療效果、副作用等是面臨的主要問(wèn)題[1-2]。目前，尋找天然有效的植物藥物對(duì)喉癌進(jìn)行預(yù)防和治療是臨床研究的熱點(diǎn)。藤梨根原產(chǎn)于中國(guó)，具有健脾胃、清熱解毒、祛風(fēng)除痹的作用。藤梨根中的三萜化合物具有抗腫瘤的活性，能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)總Cr含量發(fā)揮拮抗細(xì)胞毒性及遺傳毒性的作用[3]。該研究旨在探討太白山藤梨根提取物對(duì)人喉癌細(xì)胞HeP-2的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑來(lái)源

人喉癌HeP-2細(xì)胞株購(gòu)于南京凱基公司，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中（小牛血清購(gòu)于華美生物工程公司；RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品），體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L CO2，37℃，飽和濕度。

藤梨根購(gòu)于陜西恒慶醫(yī)藥有限公司（產(chǎn)品批號(hào)：060516），陰干后粉碎成粗粉，95%乙醇浸泡24 h（乙醇與藤梨根體積比為6：1），加熱回流提取6次，濃縮后伴入硅藻土（1：1），干燥，真空抽干，研碎成粉末，經(jīng)氯仿回流提取。將提取物用生理鹽水進(jìn)行配置。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖率測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeP-2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶（購(gòu)于Amresco公司）消化后接種于24孔培養(yǎng)板，使用計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。細(xì)胞群體倍增時(shí)間=t×lg2/（LgNt-lgNo），t為細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)時(shí)間，Nt為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的終止細(xì)胞數(shù)，No為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的起始細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 MTT（四甲基噻唑藍(lán)）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeP-2細(xì)胞，消化后（胰蛋白酶）接種于96孔培養(yǎng)板（濃度1×106個(gè)/L），24 h后細(xì)胞貼壁，加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 lg μmol/L的藤梨根提取物，對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)5 d，應(yīng)用MTT比色法測(cè)定每組在570 nm波長(zhǎng)處的吸光光度值，并根據(jù)公式將吸光光度值轉(zhuǎn)換成細(xì)胞存活率，繪制太白山藤梨根提取物對(duì)HeP-2細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeP-2細(xì)胞，消化后（胰蛋白酶）接種于96孔培養(yǎng)板（濃度1×106個(gè)/L），24 h后細(xì)胞貼壁，加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 lg μmol/L的藤梨根提取物，對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液，于藥物作用12、24、48、72、96、120 h后，應(yīng)用MTT比色法測(cè)定每組在570 nm波長(zhǎng)處的吸光光度值，并根據(jù)公式將吸光光度值轉(zhuǎn)換成細(xì)胞存活率，繪制太白山藤梨根提取物對(duì)HeP-2細(xì)胞的時(shí)間-效應(yīng)曲線。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)COX-2、P65、VEGF mRNA表達(dá) 由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成COX-2、P65、VEGF 的PCR引物，引物序列見(jiàn)表1。按照北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SYBR GREEN RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)。95℃預(yù)變性10 min，94℃ 30 s，退火30 s，68℃30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法分別評(píng)估COX-2、P65、VEGF mRNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化。

2 結(jié)果

2.1 HeP-2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖1可見(jiàn)，HeP-2細(xì)胞增殖活躍，生長(zhǎng)穩(wěn)定。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，HeP-2細(xì)胞群體倍增時(shí)間為24.5h。可見(jiàn)HeP-2細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)，適合在觀察生長(zhǎng)變化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

2.2 太白山藤梨根提取物對(duì)HeP-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

太白山藤梨根提取物作用于HeP-2細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞存活的百分率呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性，見(jiàn)圖2。

太白山藤梨根提取物各濃度作用時(shí)間在12、24、48、72、96、120 h時(shí)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

2.3 太白山藤梨根提取物對(duì)HeP-2細(xì)胞COX-2、P65、VEGF mRNA表達(dá)水平的影響

由表2可見(jiàn)，太白山藤梨根提取物作用HeP-2細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)均受到不同程度的抑制。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各作用時(shí)間的COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

喉癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界喉癌的發(fā)病率為22/100萬(wàn)，男性發(fā)病率明顯高于女性。我國(guó)是喉癌發(fā)病率較高的國(guó)家，具有地域性的特點(diǎn)，城市發(fā)病率高于農(nóng)村，華東、華北地區(qū)的發(fā)病率高于其他地區(qū)。隨著生活環(huán)境的變化和生活方式的轉(zhuǎn)變，喉癌的發(fā)病率有逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。臨床上治療喉癌常采用綜合治療的方法，手術(shù)治療是首選方法，放射治療、化療為治療喉癌的主要基礎(chǔ)手段，但耐藥性、治療效果、副作用等是面臨的主要問(wèn)題。如何改良放化療的療效和減輕不良反應(yīng)的發(fā)生是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。尋找天然有效的植物藥物對(duì)喉癌進(jìn)行預(yù)防和治療具有十分重要的意義。

藤梨根為獼猴桃科軟棗獼猴桃Actinidiaarguta Planch的根，絕大部分原產(chǎn)于中國(guó)，具有健脾胃、清熱解毒、祛風(fēng)除痹的作用[4]。藤梨根中的三萜化合物具有抗腫瘤的活性，能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)總Cr含量發(fā)揮拮抗細(xì)胞毒性及遺傳毒性的作用。有研究證實(shí)，藤梨根能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮一定的抑制作用，除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。用MTT法和生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)結(jié)果表明，藤梨根提取物對(duì)胃癌細(xì)胞有明顯的抗增殖作用，抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。倒置顯微鏡下，不同濃度的藤梨根提取物作用于胃癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞之間距離增大，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多[5-6]。董晶等[7]在研究中證實(shí)，藤梨根能夠?qū)Y(jié)腸分化腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞發(fā)揮明顯的殺傷作用。目前，關(guān)于藤梨根對(duì)喉癌的相關(guān)作用的報(bào)道較少。

該研究中，將太白山藤梨根提取物作用于喉癌細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)，隨著藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞存活的百分率呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，將各濃度太白山藤梨根提取物作用12、24、48、72、96、120 h時(shí)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，HeP-2細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢(shì)。表明太白山藤梨根提取物對(duì)人喉癌HeP-2細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒性作用。

VEGF是可溶性的血管形成因子，多種腫瘤細(xì)胞中的VEGF表達(dá)水平均較高。研究證實(shí)，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。環(huán)氧化酶（COX）是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素的限速酶。COX-2是COX的同工酶，除了在人體正常的生理功能中發(fā)揮重要作用，還與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，據(jù)研究結(jié)果顯示，COX-2抑制劑能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。NF-κB是具有多種生物學(xué)作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。P65是NF-κB的亞單位，是NF-κB發(fā)揮生物學(xué)功能的重要成分[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，太白山藤梨根提取物作用HeP-2細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)均受到不同程度的抑制，COX-2 mRNA、P65 mRNA、VEGF mRNA均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明太白山藤梨根提取物能夠通過(guò)下調(diào)COX-2、P65、VEGF的表達(dá)來(lái)抑制人喉癌細(xì)胞HeP-2的生長(zhǎng)。

綜上所述，太白山藤梨根提取物能夠抑制人喉癌細(xì)胞HeP-2的增殖，這種抑制作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性，其抑制作用可能與下調(diào)COX-2、P65、VEGF的表達(dá)密切相關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李燕， 朱力， 羅偉， 等. 手術(shù)與手術(shù)聯(lián)合放化療對(duì)70例喉癌患者的臨床效果比較[J]. 實(shí)用癌癥雜志， 2018， 33（2）： 236-239.

[2] Tao Y， Tao T， Gross N， et al. Combined Effect of IL-12Rβ2 and IL-23R Expression on Prognosis of Patients with La