丙泊酚通過降低眶額葉皮層神經元興奮性下調大鼠認知功能研究*

楊明友 ，張 超 ，葉建寧 ，張 銘 ，易 斌 ，魯開智 ，王文聰 ，3△

（1.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院手術麻醉科，重慶 400038； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院神經內科，重慶 400038； 3.三博江陵醫院麻醉科，重慶 400021）

丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物［1-3］。研究表明，丙泊酚麻醉后受試者不能維持覺醒，表現出學習記憶和決策等認知功能下調［4-6］。目前，丙泊酚麻醉如何下調學習記憶功能的神經機制尚不完全清楚。有研究表明，丙泊酚可直接作用于學習記憶相關的海馬和內嗅皮層腦區。在海馬區，丙泊酚可抑制神經元興奮性，降低突觸傳遞效率和可塑性，并抑制乙酰膽堿遞質釋放［7-11］；同時，下調內嗅皮層神經元的活動［12］?？纛~葉皮層興奮性與覺醒程度密切相關，并對學習記憶、決策及執行功能起重要作用。在靈長類和嚙齒類動物中，損毀眶額葉皮層可損害動物的反轉學習記憶功能和認知的靈活性［13-16］。采用正電子計算機斷層（PET）技術監測人腦活動，發現丙泊酚麻醉率先使眶額葉皮層活動下降，而對其他新皮層作用較?。?7］，提示眶額葉與丙泊酚麻醉密切相關。本研究中通過神經藥理學、免疫組化及行為學檢測方法，探討在眶額葉皮層微注射丙泊酚對學習記憶功能及神經元活動的影響，以期進一步闡明丙泊酚麻醉效應，特別是麻醉中認知下調的神經機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物與分組：健康雄性SD大鼠26只，2個月月齡，清潔級，體質量250～300 g，雄性，購于陸軍軍醫大學動物中心，動物合格證號為SCXK（渝）-PLA-20160011，實驗操作符合陸軍軍醫大學動物倫理規范。行為實驗中，共使用26只大鼠：14只大鼠隨機分為2組（溶劑對照組和丙泊酚處理組，各7只，用于T-迷宮實驗監測反轉學習記憶；12只大鼠隨機分為2組（溶劑對照組和丙泊酚處理組，各6只，用于開場實驗。

試藥：丙泊酚（批號為 56931，分析純，純度≥98% ），多聚甲醛（批號為 16005，純度≥98% ），4′，6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI），批號為 D9542，純度≥98%），均購于美國Sigma公司；c-fos免疫組化染色的一抗（批號為ab208942）和二抗（批號為ab150113）均購于英國Abcam公司。

儀器：IVM-1000型微量注射泵（英國Scientifica）；T-迷宮行為檢測裝置及配套動物軌跡視頻追蹤系統，開場行為檢測設備及配套動物軌跡視頻追蹤系統（中國上海欣軟信息科技公司）；CM 1900型冰凍切片機（德國Leica公司）；腦立體定位儀（中國深圳瑞沃德公司）。

1.2 方法

1.2.1 埋置給藥導管及微量給藥

將大鼠用3%戊巴比妥鈉進行麻醉（每100 g體質量0.25 mL，腹腔注射），置腦立體定位儀，用酒精和碘伏消毒后，剪開顱骨表面皮膚及去除軟組織，暴露顱骨。用過氧化氫擦拭顱骨表面，暴露前囟和后囟點。明確眶額葉額葉皮層定位坐標（anteroposterior：+3.7 mm，middle-lateral：±2.5 mm，dorsoventral：-4.0 mm）。根據上述坐標，用牙科鉆制作下導管的骨孔，在骨孔周圍安裝固定螺絲，完成后用微推將導管（中國深圳瑞沃德公司）埋植于眶額葉皮層。用牙科水泥將固定螺絲和導管固定。手術完成后，將大鼠置飼養籠恢復，恢復5～7 d后進行T-迷宮或開場實驗檢測。

采用微量注射泵進行微量給藥，在眶額葉給藥體積為 0.5 μL，丙泊酚的濃度為 50 μmol／L［12，18］。微量給藥速度為每 2 min0.5 μL，給藥完成后留針 2 min，使藥物擴散。給藥后15 min進行T-迷宮或開場實驗檢測。

1.2.2 T-迷宮檢測反轉學習記憶能力

限食：訓練前4 d進行食物攝取限制（每天給予大鼠約10～15 g食物），使大鼠體質量降至85%。

環境適應：在動物進行限食過程中，同時讓大鼠在T迷宮中適應，讓動物在撒有食物粒的T-迷宮中自由探索8～10 min。

T-迷宮測試：T-迷宮主要由1個中心臂及2個選擇臂構成（各臂長50 cm，寬20 cm）。共訓練10 d，前6 d將食物固定于T-迷宮的左側，每天進行10次訓練，每次間隔30 s。訓練時讓大鼠從中央臂的起點出發到左右的選擇臂尋找食物（放于選擇臂末端）。訓練6 d后，將食物放于T-迷宮的右側，繼續訓練4 d。每次訓練前，眶額葉皮層給予溶劑或丙泊酚，給藥15 min后進行訓練。動物若能準確找到食物，記錄1次正確的選擇；反之，則記錄為1次錯誤的選擇。

1.2.3 開場實驗

開場為1 m×1 m×1 m的盒子（開口、黑色）。每只大鼠僅接受1次測試，測試前15 min在眶額葉皮層給藥。大鼠放于入開場的中心區域，自由探索5 min。利用視頻追蹤系統檢測大鼠在開場中的運動距離、站立次數、進入中心區域的次數及距離。

1.2.4 導管埋置位點檢測

完成行為檢測后，采用生理鹽水（37℃）+4%多聚甲醛（4℃）進行灌注和固定。灌注固定后取腦組織。大腦在4%多聚甲醛中固定，完成后轉移至30%蔗糖+4%多聚甲醛溶液中進行脫水。腦組織沉底后，進行冰凍切片（厚度40 μm）。按冠狀面對眶額葉皮層連續切片，對切片進行DAPI染色。完成后進行封片，在熒光顯微鏡下檢測導管埋置位置是否位于眶額葉皮層。導管埋置不準大鼠不納入統計。

1.2.5 c-fos免疫組織化學熒光染色

按照1.2.1項下方法操作，在眶額葉皮層微量注射溶劑和丙泊酚。為排除眶額葉皮層自身晝夜節律影響，注射溶劑和丙泊酚在固定時間點（19：00）。完成注射90min后，按照1.2.4項下方法進行灌注固定。將腦組織置4%多聚甲醛外固定過夜，30%蔗糖［磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配置］脫水過夜。切片 30 μm，PBS 中保存。一抗染色，濃度 1 ∶200，4 ℃ 24 h，室溫 2 h，PBS 漂洗 10 min，共 3次。DAPI染色 5 min，1×PBS漂洗 10 min 1次，二抗避光染色，濃度為 1∶200，2 h，1×PBS漂洗 10 min 3次。貼片后80%甘油封片，顯微鏡下觀察眶額葉皮層c-fos的表達。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0和Sigma Plot軟件分析。計量資料用表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 引起大鼠反轉學習能力受損

采用T-迷宮檢測大鼠反轉學習記憶能力（圖1 A）。前6 d，將食物固定于T-迷宮的左側臂，隨著訓練的天數增加，大鼠在T-迷宮中選擇正確率亦逐漸增加；第6天，兩組動物選擇的正確率均達到80%（圖1 B）；隨后，檢測大鼠反轉學習記憶能力，在眶額葉皮層給藥后，大鼠在反轉學習過程中選擇正確率顯著低于對照組動物（圖1 B），表明丙泊酚可作用于眶額葉皮層損害大鼠的反轉學習記憶能力。

2.2 對大鼠運動、探索動機和情緒行為無明顯效應

反轉學習也可能受到非特異性因素的干預，如情緒和探索動機?？纛~葉皮層微注射丙泊酚對大鼠在開場中的運動距離和站立次數無明顯效應（圖2 A至圖2 C），表明丙泊酚在眶額葉皮層并不影響大鼠的運動功能和探索行為。同時，眶額葉皮層給予丙泊酚不影響大鼠進入開場中心區域的次數和運動距離（圖2 D至圖2 E），表明大鼠的焦慮情緒行為未受到影響。

圖1 眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠反轉學習記憶能力的損害

圖2 眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠在開場中的運動距離和站立次數影響

2.3 可降低眶額葉皮層神經元的興奮性

采用免疫組化檢測c-fos蛋白表達，分析給藥后眶額葉皮層神經元興奮性的變化。給藥后眶額葉皮層熒光信號較弱，且c-fos陽性神經元的數量顯著減少（圖3），表明丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層神經元的興奮性。

圖3 各組動物眶額葉皮層c-fos免疫組化染色結果（免疫組織化學熒光染色，×200）

3 討論

丙泊酚麻醉導致覺醒不能維持，表現為認知功能嚴重下調。在眶額葉局部微注射丙泊酚引起大鼠在T-迷宮中的正確選擇率嚴重下降；開場實驗中，眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠的運動、情緒和探索動機無明顯效應，可引起c-fos陽性神經元數量減少。結果表明，丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層興奮性，引起警覺及認知功能下調。

眶額葉皮層主要接受體感皮層、背縫核、邊緣皮層和海馬的輸入，主要投射至前額葉和腹側被蓋區［19-21］。靈長類動物中，損毀眶額葉皮層動物在學習記憶任務中選擇的錯誤次數增多。嚙齒類動物中，抑制或損毀眶額葉皮層可造成反轉學習記憶或認知的靈活性受損［13，22］。反轉學習與眶額葉皮層神經元放電編碼模式和神經元集群網絡振蕩密切相關。采用多通道記錄技術監測眶額葉皮層神經元的放電，發現在反轉學習過程中，眶額葉皮層神經元放電能表征環境信號所預測的結果［23-24］。通過c-fos標記技術發現，丙泊酚可能是通過下調眶額葉皮層的神經元興奮，抑制神經元的特定編碼模式，進而造成反轉學習功能受損。

在新皮層及皮層下區域，丙泊酚可直接作用于神經元的胞體，增強神經元的鉀通道或抑制超極化激活非選擇性陽離子通道，產生外向電流，導致神經元發生超極化，引起興奮性下降。丙泊酚同時可增強GABAA型受體介導的抑制性輸入，間接地抑制神經元活動［12，18，25-27］。但本研究側重于行為學和形態學的觀察，丙泊酚調控眶額葉皮層的離子通道機制尚不清楚，還需進一步研究。

丙泊酚作為常用麻醉藥物，具有起效快、蘇醒快的特點，其麻醉的顯著特征為認知功能下調［4-5］。丙泊酚可直接作用于眶額葉皮層，通過抑制該腦區活動進而下調學習記憶功能，表明眶額葉皮層是丙泊酚發揮麻醉效應重要的靶區。