響應面法優化鹽膚木總鞣質回流提取工藝*

葉永華 ，楊 玲 ，徐 偉 ，連 紅 ，許 文 ，葉 淼 ，鄭海音

（1.福建中醫藥大學藥學院·生物醫藥研發中心，福建 福州 350122； 2.福州海王金象中藥制藥有限公司，福建 福州 350014； 3.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

鹽膚木RhuschinensisMills.為漆樹科Anacardiaceae鹽膚木屬Rhus落葉小喬木［1］，其葉上的蟲癭稱為五倍子，主要由五倍子蚜Melaphis chinese（Bell）Baker寄生而形成［2］。五倍子具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿等功效，臨床用于治療肺虛久咳、肺熱痰嗽、久瀉久痢、自汗盜汗、消渴、便血痔血、外傷出血、癰腫瘡毒、皮膚濕爛等，其主要藥效物質為鞣質類成分等。鞣質是一類具有沉淀蛋白質特性的多元酚類化合物［3］，存在于很多植物，具有顯著清除自由基及抗腫瘤等藥理作用［4］。陳丹妮等［5］利用響應面法優化了五倍子中鞣質的提取工藝，但鹽膚木中產生蟲癭的量很少，即從鹽膚木蟲癭即五倍子中獲得活性鞣質，難以滿足現代中藥業的需求。本課題組前期開展了鹽膚木藥材的化學成分研究［6］，發現鹽膚木根中也富含與五倍子一致的鞣質類成分，同時現代化學研究也表明鹽膚木藥材和其蟲癭一樣，含有相同的鞣質類成分［7-10］，對于鹽膚木的提取工藝研究僅有針對黃酮類成分的方法［11-12］，對鞣質提取工藝的研究鮮有報道。因此，本研究中在單因素考察基礎上，采用響應面法設計優化鹽膚木總鞣質的提取工藝，為鹽膚木總鞣質的開發利用奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：UV-1800型可見分光光度計（日本島津公司）；CPA225D型天平（十萬分之一，德國賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FY135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試藥：鹽膚木（安徽協和成藥業飲片有限公司，批號為15122201），經福建中醫藥大學范世明高級實驗師鑒定為鹽膚木Rhus chinensisMills.的干燥根，標本（編號為YFM20151003）存放于福建中醫藥大學生物醫藥研發中心標本室；沒食子酸（純度≥90.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110831-201605）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸、乙醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取沒食子酸對照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加水充分溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，并加水定容，搖勻，即得質量濃度為0.05 g／L對照品溶液。

2.2 含量測定方法

鞣質含量＝總酚酸含量-不被吸附的多酚含量［13］。

總酚酸含量測定：精密量取供試品溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL、水11.0 mL，用 29.0%Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，放置35 min，以相應試劑為空白，按紫外-可見分光光度法在760 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算含量。

不被吸附的多酚含量測定方法：精密量取供試品溶液3.0 mL，置于已加入0.6 g干酪素的具塞錐形瓶中，加水，補足體積至100.0 mL，密塞，于30℃水浴中保溫1 h，實時振搖，于最后10 min靜置，取出，放冷，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，精密量取續濾液3.0 mL，依法測定總酚酸的吸光度，根據標準曲線計算不被吸附的多酚含量。

取干酪素0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入100.0 mL水，同法制備空白溶液，進行干酪素空白干擾試驗。

2.3 線性關系考察

精密量取沒食子酸對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，分別加入磷鉬鎢酸溶液 1.0 mL，再分別加水 11.5，11.0，10.0，9.0，8.0，7.0 mL，最后分別用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置35 min，以同樣處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線，得線性回歸方程Y＝89.83X+0.021，r＝0.999 9（n＝6）。結果表明，沒食子酸質量濃度在 1.0 ～10.0 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4 提取工藝單因素考察

評價指標：以總鞣質提取率為評價指標考察，總鞣質提取率＝總鞣質含量（mg）／藥材質量（g）×100%。

乙醇提取濃度：精密稱取鹽膚木粉末5.0 g，置錐形瓶中，提取液料比20∶1，乙醇提取溶劑比例分別設為40%，50%，60%，70%，80%，浸漬 30 min，回流提取 1 h，按2.2項下方法測定總鞣質含量，結果見圖1 A。乙醇濃度在40%～60%，總鞣質提取率與乙醇提取濃度呈正相關，但超過60%乙醇濃度后，總鞣質提取率反而下降。初步確定乙醇提取濃度為50% ～70%。

提取溫度：精密稱取鹽膚木粉末5.0 g，置錐形瓶中，加入20倍量60%乙醇提取溶劑，提取溫度分別設置為 40，50，60，70，80 ℃，浸漬 30 min，分別提取 1 h，按2.2項下方法測定總鞣質含量，結果見圖1 B。40～70℃時，總鞣質提取率隨溫度的升高而升高，但超過70℃后，提取率反而下降。初步確定提取溫度為60～80℃。

液料比：取鹽膚木粉末5.0g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入 5，10，15，20，25 倍量的 60%乙醇浸漬 30 min，回流提取1 h，按2.2項下方法測定鹽膚木中總鞣質的含量，結果見圖1 C。隨著液料比的增大，總鞣質的提取率亦逐漸增大，液料比超過20∶1后，總鞣質的提取率基本趨于穩定。因此選擇液料比為15∶1～25∶1。

圖1 提取影響因素考察結果

提取時間：取鹽膚木粉末5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入20倍量的60%乙醇，浸漬30 min后，回流提取時間分別設置為 30，60，90，120，150 min，按 2.2 項下測定總鞣質含量，結果見圖1 D。隨著提取時間的延長，總鞣質提取率逐漸上升，提取時間超過120 min后提取率略有下降。因此，選擇提取時間為60～120 min。

回流提取次數：取鹽膚木粉末5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入20倍量的60%乙醇，浸漬30 min，回流提取 1 h，提取 1，2，3次，按 2.2項下方法測定提取液中總酚酸含量，結果見圖1 E。隨著提取次數的增加，總鞣質提取率逐漸降低，提取3次后已提取完全。為了節省試劑、時間等，確定提取次數為2次。

2.5 響應面法優化試驗設計

2.5.1 因素水平確定

根據Box-Benhnken的中心組合設計原理，在單因素考察基礎上，以乙醇濃度（因素A）、料液比（因素B）、提取溫度（因素C）、提取時間（因素D）為自變量，以鹽膚木總鞣質提取率（Y）為響應值進行試驗設計［5］。確定各單因素對于鹽膚木中總鞣質提取的顯著性及各因素的最佳提取條件，其因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.5.2 響應面分析與提取工藝優化

結合單因素試驗結果，以總鞣質為指標，以乙醇提取濃度（因素A）、液料比（因素B）、提取溫度（因素C）及提取時間（因素D）為考察因素，結果見表2。

采用Design-Expert8.0.6軟件進行多項式回歸擬合，建立多元二次響應面回歸模型：Y＝2.08-1.000E-002A+0.034B-0.021C+0.018D-0.047AC+0.022BC-0.067CD-0.017A2-0.041B2-0.039C2-0.10D2。因素的 ANOVA 分析見表 3。可見，F模擬＝21.89，且P＜0.000 1，表明該模型差異有統計學意義，方程與實際的擬合情況相符；失擬項P＝0.057 4，提示失擬檢測無顯著性，表明未知因素對試驗的干擾較小；模型擬合相關系數R2＝0.934 1，表明模型可信度較好，該模型可應用于分析和預測提取工藝參數。

擬合回歸方程各項方差分析結果表明，對于響應值Y，因素一次項 B，C，D，交互項 AC，CD，二次項 B2，C2，D2都對總鞣質提取率的影響顯著，其余均無顯著性，提示各影響因素與提取率之間并非簡單的線性關系。由表3可見，單因素A，B，C，D的F值大小分別為2.28，26.57，9.88，7.65，提示單因素對提取率的影響順序為B＞C＞D＞A。

表2 鹽膚木總鞣質的提取工藝Box-Benhnken中心組合試驗結果

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析

響應面分析的等高線圖和響應面圖見圖2，根據擬合模型方程可知，只有AC和CD會有相互影響，各圖為因素A～D中任意2個變量取零水平時，其余2個變量對鹽膚木總鞣質提取率的影響，可更直觀地體現2個因素對提取的影響。

圖2 等高線及響應面圖

由圖2 A可知，在因素C較小時，隨著因素A的變大，曲面變化較快，表明在因素C較小時，隨著因素A的增加，總鞣質的提取率增加。在因素C較大時，隨著因素A的增大，總鞣質提取率增加，同時出現了最高點，之后總鞣質提取率降低；由圖2 B可知，在因素C較小時，隨著因素B的變大，曲面變化較平緩，表明在因素C較小時，隨著因素B的增加，總鞣質的提取率增加較慢。而在因素C較大，隨著因素A的增大，總鞣質提取率增大，同時出現了最高點，之后總鞣質提取率降低；由圖2 C可知，在因素C較小時，隨著因素D的變大，曲面變化較快，表明在因素C較小時，隨著因素D的增加，總鞣質的提取率增加較快。在因素C較大時，隨著因素A的增大，總鞣質提取率增大，同時出現了最高點。可見，不同因素之間的交互作用對鹽膚木中總鞣質的提取有很大影響。

2.5.3 最佳試驗條件的預測與驗證

用Design-Expert軟件對鹽膚木總鞣質的提取工藝Box-Benhnken中心組合試驗結果進行分析，得到的總鞣質最佳提取條件為：因素A 70%，因素B 20.71∶1，因素C 60℃，因素D 72.57 min，鹽膚木中總鞣質提取率的預測值為2.10%。根據優選的提取工藝結果進行驗證性試驗，平行驗證3次，鹽膚木中總鞣質提取率分別為 2.10%，2.09%，2.13%，平均值為 2.11%，RSD為1.01% （n＝3），與預測值的相對偏差為 0.474% ，表明該方法優選的提取工藝可靠。

3 討論

本研究中以鹽膚木作為原料，首先比較了提取方法，如回流法、超聲法、溫浸法，結果表明，回流提取法的鹽膚木中總鞣質的提取率最高，因此本試驗采用回流提取法進行試驗；同時對于提取溶劑篩選，前期比較了丙酮、水、乙醇，發現丙酮和乙醇提取的效果接近，均高于水，鑒于丙酮屬有毒、易制毒化學試劑，故本試驗采用乙醇作為總鞣質的提取溶劑。

本研究中通過單因素考察提取時間、提取溫度、液料比和乙醇濃度對鹽膚木總鞣質提取優選的基礎上，通過Box-Benhnken的中心組合設計原理，響應面法分析各提取單因素對鹽膚木中總鞣質提取率的影響，響應面法模擬回歸方程及方差結果顯示，液料比、提取溫度、提取時間、液料比的二次方項、提取時間的二次方項、提取溫度的二次方項，以及乙醇濃度與提取溫度、提取溫度與提取時間的交互作用對鹽膚木中總鞣質提取率的影響具有顯著性，表明各單因素在鹽膚木中總鞣質的提取率存在非線性關系，即存在交互作用，各單因素影響鹽膚木總鞣質提取的順序為料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度。優化得總鞣質最佳提取條件為乙醇濃度（因素 A）70%，液料比（因素 B）20.71 ∶1，提取溫度（因素 C）60 ℃、提取時間（因素 D）72.57 min。該方法快速、簡單、準確，為鹽膚木的總鞣質的提取開發提供了參考。