基于指紋圖譜及化學識別模式的烏梅炮制品質量評價*

孫 全，徐 沖，劉 霞，郭小紅，李 杰，冷 靜

（重慶市中醫院藥劑科，重慶 400021）

烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.Et Zucc的干燥近成熟果實，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔之功效，藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，列為中品，常用于肺虛久咳，久瀉久痢，虛熱消渴，蛔厥嘔吐、腹痛等［1］?！督饏T玉函經》《備急千金要方》《外臺秘要》《普濟方》均提及烏梅炮制方法，有醋泡、醋蒸、醋煮等。2015年版《中國藥典（一部）》收載的烏梅及其飲片包括烏梅［2-3］、烏梅肉［4］、烏梅炭［5-6］。目前關于烏梅及不同炮制品指紋圖譜的比較研究少見報道。本研究中采用指紋圖譜相似度評價與化學識別模式相結合的方式［7-14］綜合分析烏梅不同炮制品的質量，為其質量控制和臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XA205DU型天平（十萬分之一，梅特勒-托利多國際貿易有限公司）；AS10200AT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

烏梅（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號為D1506073），經重慶市中醫院藥劑科副主任中藥師陳玲鑒定為正品，符合2015年版《中國藥典（一部）》烏梅項下的規定。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備

取烏梅藥材100 g，加入米醋200 mL，浸泡12 h，干燥，得醋烏梅。取烏梅肉，預熱炒藥鍋至100℃時投入烏梅肉100 g，并待鍋溫升至235℃時開始計時，控制此溫度不變，共炒制8 min，迅速出鍋，熄滅火星，攤涼即得烏梅炭［15］。取烏梅藥材 100 g，加醋 45 mL，拌勻，分別隔水蒸2，3，4 h，干燥，得不同蒸制時間的醋蒸制烏梅樣品。

2.2 提取溶劑考察

采用不同的提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）進行超聲處理，將提取液進行液相分析，30%甲醇提取液的色譜峰較多，故選擇30%甲醇作為烏梅各種炮制樣品的提取溶劑。

2.3 測定波長選擇

通過紫外全波長掃描，烏梅提取液在215，288，314 nm波長處有最大吸收，分別將215，288，314 nm作為檢測波長對烏梅進行分析，烏梅提取液在215 nm波長處的基線較平穩，色譜峰較多，故選215 nm作為檢測波長。

2.4 供試品溶液制備

取烏梅不同炮制品樣品1 g，精密稱定，加入50 mL 30%甲醇，稱定質量，超聲提取1 h，用30%甲醇補足減失的質量，提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；檢測波長：215 nm；流速：0.6 mL ／min；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表 1）。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.6 方法學考察

精密度試驗：取同一供試品溶液，精密稱定，連續進樣6次。結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.31%（n＝6），相對峰面積的RSD為 2.36% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品粉末共6份，每份約1 g，按2.1項下方法制備供試品溶液，分別進樣。結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.80%（n＝6），相對峰面積的RSD為3.67%（n＝6）。表明該方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時進樣測定。結果各共有峰相對保留時間的RSD為 0.24% （n＝5），相對峰面積的RSD為 2.95%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 對照指紋圖譜的建立

分別稱取烏梅不同炮制品樣品，按2.4項下方法制備供試品溶液。取各供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄65 min的色譜圖，導出烏梅不同炮制品色譜圖的AIA格式文件，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）進行分析。

2.8 高效液相色譜（HPLC）特征圖譜相似度分析

用中位數法建立對照指紋圖譜，并進行多點校正及色譜峰的匹配，共標定25個共有峰，各樣品選定共有峰的峰面積總和均大于50%，相對保留時間的RSD均小于1%。根據相似度評價結果，烏梅、醋烏梅、醋蒸制烏梅與對照指紋圖譜的相似度均較高；烏梅炭與對照指紋圖譜的相似度均較低。結果見圖1，表2和表3。

圖1 烏梅不同炮制品高效液相色譜特征指紋圖譜及共有模式

表2 烏梅及不同炮制品共有峰峰面積及相對峰面積

表3 烏梅及不同炮制品HPLC特征指紋圖譜相似度評價結果

2.9 主成分分析

以烏梅不同炮制品的HPLC特征指紋圖譜共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 22.0統計軟件對原始數據作標準化處理后進行主成分分析。以主成分的特征值及貢獻率為依據選擇主成分，結果見表4。前3個主成分特征值均大于1，累計貢獻率為92.468%，包含了大部分的信息。其中，主成分1的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰相對保留時間（tR）分別為 5.252，6.579，10.542，16.831，22.910，47.367 min；主成分 2 的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰的tR分別為5.053，5.629，9.608，22.910，50.961 min；主成分 3 的特征向量載荷較高且符號為正的共有峰tR分別為12.508，54.176，54.875 min。詳見圖 2。

表4 主成分特征值及貢獻率

圖2 三維載荷圖

以各樣品在主成分1、主成分2、主成分3中的得分繪制 3D 得分圖。由圖 3 可知，樣品 S1，S2，S4，S5，S6 距離較近，可分為一類。樣品S3可分為一類，主成分分析結果與相似度分析結果基本一致，進一步驗證了相似度分析的可靠性。

圖3 主成分3D得分圖

3 討論

3.1 色譜條件優化

為得到峰形，分離度較好，色譜信息較豐富的HPLC指紋圖譜，本試驗中對乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-水、甲酸-磷酸溶液等不同流動相組成及流動相比例進行了梯度洗脫考察。并考察了不同測定波長215，288，314 nm對測定結果的影響。結果以 Phenomenex C18柱作為色譜柱，檢測波長為215 nm，流速為0.6 mL ／min，柱溫為 25 ℃ ，流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脫為能得到較好指紋圖譜信息。

3.2 相似度評價與主成分分析

相似度評價結果顯示，烏梅及醋炮制烏梅與對照指紋圖譜之間的相似度較高，均在0.950以上，烏梅炭與對照指紋圖譜的相似度較低。通過繪制主成分1、主成分2、主成分3的3D得分圖，烏梅與醋烏梅在3D散點圖中的空間距離較近，可劃分為一類，而烏梅炭與烏梅及醋烏梅相距較遠，分為一類。相似度的評價結果與主成分分析結果一致，表明炒炭過程造成烏梅化學成分的變化較大。

3.3 指紋圖譜對烏梅及炮制品質量評價的意義

中藥炮制后可達到增強療效，降低毒副作用，改變或緩和藥性，引藥歸經等作用。醋制可引藥入肝經，并有引藥入血及收斂等作用。由于烏梅醋制研究現狀的薄弱，臨床用藥時往往與炭炒發生混用。烏梅不同炮制品指紋圖譜結果顯示，烏梅及醋烏梅指紋圖譜信息既有共性又有差異，化學成分種類基本一致，但峰面積有所不同。烏梅炭與烏梅及醋烏梅化學成分及含量都有較大差異。本研究中通過指紋圖譜與化學識別模式相結合的方式評價烏梅及不同炮制品的質量，可為其藥理作用的差異進一步研究及臨床用藥提供一定的依據。