正交試驗法優選山黃祛痛噴霧劑醇提工藝

林新艷，王 宓，徐 超，殷書梅

（江蘇康緣陽光藥業有限公司，江蘇 南京 210046）

山黃祛痛噴霧劑是由南京中醫藥大學汪悅教授有效驗方篩選而成的中藥注冊六類新藥，由麗江山慈菇、鳳仙透骨草等4味中藥組方，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，用于急性痛風性關節炎濕熱蘊毒證。方中君藥麗江山慈菇主要化學成分為秋水仙堿、角秋水仙堿、β-光秋水仙堿及N-甲酸-N-去乙酰秋水仙堿等多種生物堿［1］，其中有效成分秋水仙堿為小分子化合物，易溶于冷水、乙醇、氯仿等，在乙醚中極微溶解，在熱水中難溶，對急性痛風性關節炎有選擇性抑制作用。鳳仙透骨草主要化學成分為東莨菪素、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、蹄紋天竺素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷及飛燕草素-3-葡萄糖苷等，主要為黃酮苷類成分，不溶或難溶于水，在乙醇中溶解性能較好［2-3］。本研究中通過L9（34）正交試驗法，選擇秋水仙堿、槲皮素含量和出膏率為指標，考察山黃祛痛噴霧劑醇提工藝條件，提高了有效成分轉移率，為產品的制備和進一步研究提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀及DAD二極管陣列檢測器（安捷倫科技有限公司）；Mettler AB135-S型電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多公司）；SY2000型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SK8200HP型超聲波清洗機（上海科島自動化系統有限公司）。

1.2 試藥

麗江山慈菇Iphigenia indicaKunth和鳳仙透骨草Impatiens balsaminaL.均購自亳州市譙港藥業有限公司，經江蘇省食品藥品檢驗研究院胡浩斌主任藥師鑒定為正品，符合法定要求［4-5］；秋水仙堿對照品（美國sigma公司，批號為2005985，純度為98.0%）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111514-200403，純度為98.0%）；甲醇（色譜純，美國Merk公司，批號為20100825）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

以乙醇作為提取溶劑，采用L9（34）正交試驗法對乙醇濃度（因素 A）、乙醇用量（因素 B）、回流時間（因素 C）、回流次數（因素D）進行2味藥材的回流提取工藝優選，選取有效成分秋水仙堿、槲皮素含量和出膏率為指標進行測定。因素水平見表1。

2.2 正交試驗樣品制備

稱取麗江山慈菇9 g、鳳仙透骨草6 g，共9份，分別按正交試驗表所列條件回流提取，合并提取液，回收乙醇，適量濃縮，分別定容至100 mL，備用。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

2.3 秋水仙堿含量測定

2.3.1 麗江山慈菇藥材處理

取麗江山慈菇粉末0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，以70%甲醇25 mL水浴回流提取2次，每次2.0 h，放冷，濾過，濾液減壓回收至干，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 溶液制備

取秋水仙堿對照品適量，精密稱定，用70%甲醇配制成質量濃度為 0.018 9 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得對照品溶液。取醇提正交試驗樣品溶液，精密移取1 mL置25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（45 ∶55）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：245 nm；進樣量：10 μL。

2.4 槲皮素含量測定

2.4.1 鳳仙透骨草藥材處理

圖1 高效液相色譜圖

取鳳仙透骨草粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液20 mL，精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉移至50 mL容量瓶中，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4.2 溶液制備

精密稱取槲皮素對照品適量，用甲醇配制成質量濃度為 0.006 22 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得對照品溶液。

取醇提正交試驗樣品溶液，精密移取10 mL置蒸發皿中，蒸至近干，加入甲醇15 mL、25%鹽酸7 mL溶解殘渣并轉移至錐形瓶中，水浴回流30 min，濾過，轉移至25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（40 ∶60）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：360 nm；進樣量：10 μL。

2.5 指標成分含量測定結果

經高效液相色譜法［6-7］測得麗江山慈菇藥材中秋水仙堿含量為4.09 mg／g，色譜圖見圖1。根據槲皮素理化特性槲皮素含量測定方法［8］，測得鳳仙透骨草藥材中槲皮素含量為0.189 mg／g，色譜圖見圖2。

2.6 正交試驗結果與分析

9份樣品中測得的麗江山慈姑中秋水仙堿含量、鳳仙透骨草中槲皮素含量及出膏率結果見表2。按正交試驗條件采用綜合評分法，對影響提取工藝的主要因素設定權重系數，秋水仙堿轉移率（Ya）為0.5，槲皮素轉移率（Yb）為 0.3，出膏率（Yc）為 0.2，進行加權評分，公式為Y＝0.5Ya+0.3Yb+0.2Yc。方差分析結果見表 3。

圖2 高效液相色譜圖

表2 回流提取工藝正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

由方差分析結果可知，各因素對提取影響大小順序為D＞A＞C＞B，最優工藝水平為A2B3C2D2，即10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h。回流提取次數為最顯著影響因素，乙醇用量為最小影響因素，而8倍量溶劑（K＝213.29）與 10倍量溶劑（K＝213.53）在提取效率上無顯著差異。從產業化節約能耗方面考慮，宜選擇8倍量溶劑進行回流提取。

2.7 驗證試驗

取3份同批次麗江山慈菇與鳳仙透骨草藥材，按以上正交試驗優選的提取工藝進行驗證，每份樣品平行測定2次。結果3份樣品中秋水仙堿每1 g生藥平均含量分別為 3.61，3.60，3.64 mg；槲皮素每 1 g 生藥平均含量分別為 0.163，0.161，0.165 mg。驗證試驗結果顯示，優選工藝條件在有效成分提取率和重復性上具有較好優勢。

3 討論

山黃祛痛噴霧劑處方中君藥麗江山慈菇的主要成分為秋水仙堿，是痛風性關節炎有效的首選抗炎劑，對急性痛風性關節炎有選擇性抑制作用［9］，其作用機制在于秋水仙堿能和微管蛋白結合，妨礙有絲分裂中紡錘體的功能，并引起粒細胞和其他可移動細胞中原纖維微管解聚和消失。這是秋水仙堿有效作用的基礎，即抑制粒細胞移向發炎區，減少粒細胞代謝和吞噬活動［10］，減少了發生于吞噬作用的乳酸和引起炎癥的酶的前體釋放，打破炎性反應的循環。其次，鳳仙透骨草中有效成分槲皮素的藥理活性甚廣，具有抗炎、抗過敏、正性肌力作用、降低毛細血管通透性、降低血清膽固醇等作用［11-13］，同時還有良好的鎮痛作用，顯著的特點是小劑量局部用藥速效、高效。

中藥是一個物質群，其藥效作用更是物質群的綜合作用。控制中藥的內在質量，即需要對中藥內在化學物質進行控制。目前，對山黃祛痛噴霧劑復雜的物質群及其與功效之間的相互關系了解有限，因此，只能選取有限的具有生物活性的多個指標綜合考察山黃祛痛噴霧劑醇提工藝。麗江山慈菇和鳳仙透骨草在法定藥材標準中尚無含量檢測項，根據指標成分秋水仙堿和槲皮素的理化特性，確定了乙醇濃度、乙醇用量、回流時間、回流次數4個影響因素，并采用L9（34）正交試驗進行考察，最終得出回流提取最佳工藝為麗江山慈菇和鳳仙透骨草采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5h。在此條件下，秋水仙堿和槲皮素成分提取率和出膏率最高，且提取方法穩定、可靠，可為山黃祛痛噴霧劑后續產業化發展提供參考。