慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致小鼠γδT細(xì)胞數(shù)目減少①

黃曉峰 侯春梅 余海韻 杜盈瑩 孫 茗 張紀(jì)巖 林 周

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所,北京100850)

γδT細(xì)胞同αβT細(xì)胞一樣在胸腺中發(fā)育，屬于非經(jīng)典T細(xì)胞的一個小亞群，通過模式識別受體識別多種微生物產(chǎn)物后擴(kuò)增并釋放細(xì)胞因子，從而起到人體第一道免疫防線的作用[1,2]。我國正處于快速發(fā)展的轉(zhuǎn)型期，社會心理問題日益突出。慢性心理應(yīng)激會導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸持續(xù)活化，應(yīng)激激素糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺水平持續(xù)升高[3-9]，進(jìn)而導(dǎo)致經(jīng)典T淋巴細(xì)胞凋亡性減少，這可能是長期的精神壓力和情緒低落導(dǎo)致機體對于細(xì)菌和病毒感染的抵抗力下降的原因[4]。慢性心理應(yīng)激如何影響γδT細(xì)胞還不清楚。我們對此進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自中國軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物研究所，所有小鼠均在無特定病原體條件下飼養(yǎng)，所有手術(shù)均在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行，并盡一切可能減少實驗動物的痛苦。該方案得到了軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所的批準(zhǔn)。本研究中對小鼠的飼養(yǎng)、使用和治療均符合軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所制定的實驗動物使用指南。

1.1.2儀器和試劑 FACS Calibur型流式細(xì)胞儀,美國BD公司;普萘洛爾(Propranolol)、米非司酮(RU486)、多聚甲醛和疊氮鈉購自西格瑪化學(xué)公司；糖皮質(zhì)激素地塞米松(Dexamethasone)購自MP Biomedicals公司；抗小鼠CD3和 抗小鼠γδTCR的熒光結(jié)合抗體購自eBioscience公司；凋亡試劑盒購自BioLegend公司。

1.2方法

1.2.1限制性束縛應(yīng)激 按照隨機方法將小鼠分為束縛組和對照組。束縛組每只小鼠束縛在規(guī)格相同的通風(fēng)良好的50 ml錐形管中，連續(xù)束縛5個晚上，時間為下午17:00到次日早上09:00。在每個約束循環(huán)之間清潔和消毒束縛管。小鼠可以在管子里來回移動，但不能轉(zhuǎn)身。對照組小鼠雖然不受束縛，但在相同時間段內(nèi)禁食禁水。為了探討糖皮質(zhì)激素的作用，每次束縛應(yīng)激期前1 h給實驗組小鼠腹腔注射25 mg/kg RU486(溶于丙二醇/乙醇 7/3 v/v)。對照組注射相同體積的丙二醇/乙醇(7/3 v/v)。為了探討兒茶酚胺的作用，在每個束縛應(yīng)激期前1 h給實驗組小鼠腹腔注射溶于0.9%生理鹽水的10 mg/kg普萘洛爾或相同體積的0.9%生理鹽水。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù) 單細(xì)胞懸浮液在含有0.1%疊氮化鈉和2%FBS的PBS中在冰上與熒光結(jié)合抗體避光孵育30 min。同型抗體作為陰性對照。樣品細(xì)胞在染色緩沖液中清洗一次，然后在含有1%(w/v) 多聚甲醛的PBS中固定細(xì)胞并在4°C下避光保存。在Becton-Dickinson FACS Calibur machine 流式儀(BD Biosciences)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.3細(xì)胞凋亡分析 為了研究慢性心理應(yīng)激對小鼠體內(nèi)γδT細(xì)胞凋亡的影響，將脾的單細(xì)胞懸浮液在含鈣離子的300 μl結(jié)合緩沖液中重新懸浮，用抗CD3-PE、抗γδTCR-APC和Annexin V-FITC對其進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V染色的CD3+γδTCR+細(xì)胞凋亡情況。為了分析糖皮質(zhì)激素是否直接誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡，流式分選γδT細(xì)胞。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮質(zhì)激素孵育24 h后，將兩組細(xì)胞懸浮于300 μl含有鈣離子的結(jié)合緩沖液中，用抗CD3-PERCP、抗γδTCR-FITC、PI和Annexin V-APC對γδT細(xì)胞進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V/PI染色的CD3+γδTCR+細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1限制性束縛導(dǎo)致小鼠胸腺和脾臟的器官重量和細(xì)胞數(shù)量減少 限制性束縛引發(fā)持續(xù)的生理和心理壓力反應(yīng)，但對免疫器官的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)5次16 h/次束縛對體重沒有顯著影響(圖1A)，但導(dǎo)致胸腺和脾臟萎縮(圖1B)。統(tǒng)計顯示胸腺和脾臟的重量顯著下降(圖1C)、胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖1D)。因此，采用該束縛方法導(dǎo)致小鼠免疫器官受到嚴(yán)重影響。

2.2限制性束縛導(dǎo)致γδT細(xì)胞數(shù)量減少 本研究分析了胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中 CD3+γδTCR+的γδT細(xì)胞的百分比和數(shù)量。流式細(xì)胞術(shù)顯示，在應(yīng)激小鼠的胸腺中，較為成熟的CD3+γδTCR-傳統(tǒng)T細(xì)胞和CD3+γδTCR+γδT細(xì)胞的百分比都有所增加，后者增加的幅度較小(圖2A)。因為應(yīng)激小鼠胸腺中的總細(xì)胞數(shù)顯著減少，CD3+γδTCR-和CD3+γδTCR+細(xì)胞的絕對數(shù)都下降，γδT細(xì)胞絕對數(shù)的減少更為顯著(圖2B)。在脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中，γδT細(xì)胞的百分比和數(shù)量的減少程度與CD3+γδTCR-傳統(tǒng)T細(xì)胞相似(圖2C～F)。

2.3糖皮質(zhì)激素的外周作用導(dǎo)致應(yīng)激小鼠γδT細(xì)胞數(shù)量減少 慢性心理應(yīng)激與糖皮質(zhì)激素和腎上腺激素的升高有關(guān)，但糖皮質(zhì)激素和腎上腺素對于γδT 細(xì)胞是否有直接影響尚不清楚。為此，本研究首先對束縛組小鼠進(jìn)行糖皮質(zhì)激素拮抗劑RU486的全身給藥。實驗結(jié)果表明，束縛前對小鼠進(jìn)行RU486處理能顯著逆轉(zhuǎn)胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中γδT細(xì)胞數(shù)量的減少(圖3)。

圖1 限制性束縛對小鼠胸腺和脾臟的器官重量和細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.1 Effects of five 16 h restraint sessions on the organ weight and cell numbers of mouse thymus and spleenNote:The body weight was measured (A) and the thymus and spleen were isolated (B).Then the weight (C) and cell numbers of thymus and spleen (D) were measured.Results are expressed as

圖2 限制性束縛對γδT細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.2 Effects of five 16 h restraint sessions on number of γδT cellsNote：Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.A,C,E.Representative data；B,D,F.Absolute numbers.Results are expressed as

圖3 糖皮質(zhì)激素受體抑制劑對γδT細(xì)胞數(shù)量下降的影響Fig.3 Effects of glucocorticoid receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Percentages and cell numbers of γδT cells in immune organs.A.Represent date;B-D.Absolute numbers.Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.Results are expressed as

2.4兒茶酚胺在應(yīng)激小鼠γδT細(xì)胞數(shù)量減少中的作用不明顯 為了分析兒茶酚胺在慢性心理應(yīng)激條件下γδT細(xì)胞減少中的作用，每次束縛前對小鼠進(jìn)行普萘洛爾全身給藥，試驗結(jié)果表明，在5次束縛后，普萘洛爾對γδT細(xì)胞的減少幾乎沒有影響(圖4)。

圖4 β腎上腺素能受體抑制劑對γδT細(xì)胞數(shù)量下降的影響Fig.4 Effects of beta-adrenergic receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Mononuclear cells from the spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flowcytometry for CD3 and γδTCR staining.A.Representative data；B and C.Absolute numbers.Results are expressed as

圖5 糖皮質(zhì)激素對γδT細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of glucocorticoid on apoptosis of γδT cellsNote：A-C.γδT cells were isolated from single-cell suspensions of the spleen.The purity of γδT cells was about 70% as confirmed by flow cytometry (A).After incubation with or without 0.1 mg/ml glucocorticoid for 24 h,apoptosis of γδT cells was assessed by flow-cytometric analysis of Annexin-V/PI staining in CD3+γδTCR+ cells；D-F.C57BL/6 mice were subjected to five 16 h restraint sessions or left untreated,n=3.Mononuclear cells from the spleen were subjected to apoptosis analysis for Annexin-V staining in CD3+γδTCR+ cells.B，D and E.Representative data；C and F.Statistical data expressed as

2.5糖皮質(zhì)激素直接誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡 為了探索糖皮質(zhì)激素是否像在傳統(tǒng)T細(xì)胞中那樣誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡，我們從脾臟中純化了γδT 細(xì)胞。如流式細(xì)胞術(shù)所證實，γδT細(xì)胞的純度約為70%(圖5A)。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮質(zhì)激素孵育24 h后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin-V/PI染色的CD3+γδTCR+來評估γδT 細(xì)胞的凋亡情況。如圖5B和5C所示，糖皮質(zhì)激素可以在體外直接誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡。與對照組小鼠相比，應(yīng)激組小鼠脾臟中的γδT細(xì)胞凋亡率始終高于對照組小鼠(圖5E和5F)。

3 討論

有文獻(xiàn)報道提示腸黏膜中γδT細(xì)胞在應(yīng)激壓力下數(shù)量減少[10]。在這項工作中，我們發(fā)現(xiàn)在慢性心理應(yīng)激狀態(tài)，胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中γδT細(xì)胞減少。因此，γδT細(xì)胞非常容易受到心理壓力的影響，類似于傳統(tǒng)的T細(xì)胞。 慢性心理應(yīng)激與持續(xù)升高的應(yīng)激激素(如糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺)水平有關(guān)[3,6]。我們發(fā)現(xiàn)全身給予糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU486逆轉(zhuǎn)γδT細(xì)胞數(shù)的降低，而β腎上腺素能受體抑制劑普萘洛爾對γδT細(xì)胞的減少幾乎沒有影響。因此，在慢性心理應(yīng)激過程中，糖皮質(zhì)激素的作用應(yīng)該比兒茶酚胺更重要。此外，糖皮質(zhì)激素在體外直接誘導(dǎo)純化的γδT細(xì)胞凋亡，這與應(yīng)激小鼠脾臟中γδT細(xì)胞的凋亡增強一致。因此，慢性心理應(yīng)激通過糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致γδT細(xì)胞凋亡。γδT細(xì)胞是人體抗感染免疫第一道防線的關(guān)鍵組成成分[2]。慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致生物宿主對細(xì)菌和病毒感染的防御能力下降。因此，上述的研究結(jié)果表明，慢性心理壓力下γδT 細(xì)胞的減少降低了生物宿主抵抗各種感染的能力。