皮肌炎患者外周血單核細胞PD-L1分子的表達及其臨床意義①

林嘉鴻 陳國強 張紅衛 黎志鋒

(佛山市第一人民醫院風濕免疫科,佛山528000)

皮肌炎(Dermatomyositis，DM)是一組以肌無力和皮疹為特點的異質性、系統性自身免疫性疾病[1]，其中Gottron征是皮肌炎特異性皮損表現之一，表現為指指關節、掌指關節伸側的扁平紫紅色丘疹。皮肌炎的發病機制復雜且尚未完全明確，但有研究發現皮肌炎病人受累的肌纖維周圍有大量的T細胞浸潤，部分病人常有多克隆的高球蛋白血癥，表明多種免疫細胞如T細胞、B細胞、抗原提呈細胞的異常活化可能參與本病[2]。

共刺激分子是免疫細胞之間信號傳導的主要橋梁，其中正性共刺激分子和負性共刺激分子組成了一個錯綜復雜的信號體系，綜合調節免疫反應，在免疫活化和耐受中發揮重要作用。其中PD-L1、PD-L2是程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)的配體，而PD-1/PD-L1/PD-L2是對T細胞活化起負性調控的協同刺激分子信號通路，研究發現，它們在自身免疫性疾病和腫瘤的發病中起重要作用[3,4]。目前關于PD-L1在系統性紅斑狼瘡[5,6]、干燥綜合征[7]等自身免疫性疾病的作用已有多篇報道，但有關PD-L1與皮肌炎間的相關報道甚少。本研究擬通過流式細胞術分析PD-L1在皮肌炎病人外周血單核細胞的表達，并分析其與炎癥指標、皮損和肺間質病變等臨床特征的相關性。

1 資料與方法

1.1資料 25例皮肌炎患者均來自2015年1月至2018年1月收治于我院風濕免疫科患者，其中男10例，女15例；年齡(56.1±11.2)歲。臨床診斷符合皮肌炎診斷標準(Bohan等[8]建議的皮肌炎診斷標準)，并且在納入研究前半年內均未接受過激素或免疫抑制劑治療。25例健康對照組的外周血來自2017年12月的按照年齡、性別匹配的健康體檢者。

1.2方法 流式細胞術檢測PD-L1的表達利用流式細胞術評價外周血單核細胞上PD-L1的表達。采集受試者清晨空腹狀態下外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，Ficoll梯度分離外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)經PBS洗滌后配置成1×106細胞懸液，取50 μl分別與3 μl FITC標記CD14抗體(BD公司，美國)以及APC標記的PD-L1抗體(Invitrogen公司，美國)共孵育30 min，PBS洗滌后上機檢測。

2 結果

2.1皮肌炎患者外周血單核細胞PD-L1表達水平升高 皮肌炎患者外周血單核細胞中PD-L1表達水平(20.69±1.10)%明顯高于健康對照組(10.86±0.79)%，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2PD-L1與炎癥指標的關系 紅細胞沉降率(Erythrocyte sedimetation rate,ESR)和C反應蛋白(Creatcive protein,CRP)是反映皮肌炎活動的炎癥指標。根據ESR、CRP是否升高，將皮肌炎患者分別分為ESR升高組(16例)和ESR正常組(9例)，CRP升高組(17例)和CRP正常組(8例)。分析各組間外周血單核細胞中PD-L1表達差異。ESR升高組外周血單核細胞中PD-L1表達水平(22.64±1.35)%明顯高于ESR正常組(17.22±1.30)%，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。CRP升高組外周血單核細胞中PD-L1表達水平(22.99±1.15)%明顯高于CRP正常組(15.80±1.26)%，差異有統計學意義(P<0.05,表2)。

GroupsnPD-L1+(%)DM patients2520.69±1.101)Healthy controls2510.86±0.79

Note：1)P<0.05.

2.3PD-L1與典型皮損的關系 根據有無Gottron征，將皮肌炎患者分為Gottron征組(19例)和無Gottron征組(6例)，比較各組間外周血單核細胞中PD-L1表達差異。Gottron征組患者外周血單核細胞中PD-L1表達水平(22.15±1.26)%明顯高于無Gottron征組(16.07±0.82)%，差異有統計學意義(P<0.05,圖1)。

2.4PD-L1與肺間質病變的關系 根據有無肺間質病變(符合下列診斷標準中1項及1項以上，且發病時病原學檢查排除肺部感染：①肺功能異常，具體表現為限制性通氣功能障礙，彌散功能降低，CO彌散率<80%時具有診斷意義；②不明原因的靜息或活動后氣促；③不明原因咳嗽>3個月；④肺部聽診聞及Velcro啰音；⑤肺高分辨率CT有肺間質病變的影像學改變)，將皮肌炎患者分為伴肺間質病變組(6例)和無肺間質病變組(19例)，比較兩組間外周血單核細胞中PD-L1表達差異，伴肺間質病變組外周血單核細胞中PD-L1表達水平(26.88±2.05)%明顯高于無肺間質病變組(18.74±0.94)%，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

Inflammatory markersnPD-L1+(%)ESR High1622.64±1.351) Normal917.22±1.3CRP High1722.99±1.151) Normal815.80±1.26

Note：1)P<0.05.

圖1 有和無Gottron征皮肌炎患者外周血CD14+單核細胞PD-L1表達水平的比較Fig.1 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without Gottron′s signNote: *.P<0.05.

圖2 有和無肺間質病變皮肌炎患者外周血CD14+單核細胞PD-L1表達水平的比較Fig.2 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without interstitial lung diseaseNote：*.P<0.05.

3 討論

皮肌炎是一種以橫紋肌炎性細胞浸潤為特點的自身免疫性疾病，可累計肺臟等多種重要臟器，致死率高，該病的具體發病機制尚未完全明確，目前知道T細胞介導的細胞免疫可能參與該病。T細胞活化需要雙重信號，除MHC-抗原肽-TCR相互結合產生第一信號外,還需要T細胞表面受體與APC表面的相應配體等共刺激分子結合產生第二信號，這些共刺激分子在免疫應答中起著至關重要的作用，介導和參與腫瘤、感染及自身免疫性疾病等[9-12]。目前已有多種協同刺激信號通路被發現及研究，其中PD-1/PD-L1信號通路是一種負性協同刺激信號通路，可以傳導抑制性的信號而調節T細胞的活化和耐受，從而介導和/或破壞免疫平衡(自身耐受性)，參與系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等多種自身免疫性疾病及腫瘤性疾病[13-15]。其中SLE患者外周血PBMC中存在PD-1及PD-L1表達異常，導致機體免疫耐受失調而產生自身抗體[16]。干燥綜合征患者唾液腺淋巴細胞PD-1表達上調，腺泡和導管上皮細胞上的PD-L1也存在表達上調[7]。

但截至目前為止尚無PD-L1與皮肌炎的相關報道，本研究提示PD-L1在皮肌炎的單核細胞表面異常表達，并可能與肌炎、皮損和肺間質病變等疾病活動相關。

作為負性調控信號，PD-L1/PD-1主要抑制T細胞活化和增殖。病原菌通過PD-L1/PD-1信號通路抑制宿主免疫防御，而使病原菌感染持續。腫瘤組織通過PD-L1/PD-1信號通路抑制特異性T細胞免疫，從而避免被T細胞殺傷[17]。但在本研究中，皮肌炎患者單核細胞的PD-L1表達水平明顯高于健康對照組，且皮肌炎患者單核細胞PD-L1表達水平與炎癥指標、肌炎、皮損、肺間質病變呈正相關，提示單核細胞PD-L1表達水平越高，病情活動度越高。這一結果與感染和腫瘤中PD-L1抑制T細胞的活性作用明顯不同。因此，我們猜測皮肌炎患者中單核細胞表達的PD-L1可能向T細胞提供正向調控信號，從而參與及加重皮肌炎病情。

總之，皮肌炎患者外周血單核細胞的PD-L1分子表達水平存在異常，并且與疾病活動相關，但其具體作用機制仍需進一步研究。若條件允許，后期我們將進一步擴大樣本量來驗證實驗結果,此工作可能為進一步探討PD-L1分子的生物學功能及皮肌炎的發病機制提供線索。