諾米林通過抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路減輕克雷伯菌老年肺炎大鼠模型炎癥反應①

劉澤明 孫 穎 高玉春 龍懷聰 雷 霆 杜恒健

(西南醫科大學附屬醫院感染科，瀘州646000)

急性下呼吸道感染是老年人發病和致死的重要原因[1]。肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，是一種常見的下呼吸道感染引起的疾病，可由細菌、病毒、支原體等多種疾病微生物，放射線、吸入性異物等理化因素，免疫損傷，過敏及藥物引起。其中細菌性肺炎是最常見的肺炎。肺炎是世界范圍內傳染病死亡的主要原因之一，死亡率高達20%～30%[2,3]。開發有效的肺炎治療方法對人類醫療健康事業的發展至關重要。據報道許多天然產物在各類疾病治療中具有積極作用。檸檬苦素類化合物是柑橘類水果如檸檬、橙子、佛手柚等種子、水果和果皮組織中高含氧萜類化合物的次生代謝產物，具有多種藥理學活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒及殺菌等[4]。檸檬苦素類化合物包括檸檬苦素、葛杜寧、黃柏酮及印楝素等。諾米林(Nomilin)是一種常見的檸檬苦素類化合物，具有抗癌細胞增殖、抗高血糖及減肥等功效[5,6]。但諾米林在肺炎中的作用還尚不清楚，有待進一步研究。本研究的主要目的是探究諾米林對克雷伯菌(Klebsiella)老年肺炎大鼠模型炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1材料 50只20～22月齡的SD大鼠購自中國科學院實驗動物中心?？死撞鷣碓从谥袊镏破窓z驗鑒定所，菌株編號：K46114，用無菌生理鹽水稀釋到2×108ml-1。諾米林(分析純)購自Sigma-Aldrich公司。蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色液和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自Solarbio。白細胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。PE-CD14抗體、抗CD14抗體、抗TLR4抗體、抗NF-κB P65和抗p-P65抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1肺炎模型的建立 首先腹腔注射10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后將大鼠四肢和牙齒固定于固定臺上，用止血鉗夾住大鼠的舌，固定于外，經上中切牙點懸掛。然后用注射劑鈍圓針頭經口插入氣管，滴入克雷伯菌液0.28 ml/kg，此時感染的大鼠保持原位約10 min，使菌液充分流入肺泡內，以達到肺部感染的目的。對照組給予等量的生理鹽水。第二天大鼠出現體溫升高，躁動或少動，撓鼻，打噴嚏，呼吸急促，弓背，站立不穩，四肢癱軟，腹肌痙攣，飲食飲水下降等癥狀說明建模成功。

1.2.2動物分組及藥物處理 大鼠隨機分為5組：健康對照組(Ctrl)、克雷伯菌肺炎模型組、諾米林(10、25、50 mg/kg BW)治療組，每組10只。除對照組外，其他組大鼠按上述方法接種克雷伯菌進行肺炎模型的建立。建模第二天開始給藥，諾米林組腹腔注射10、25、50 mg/kg BW的諾米林，克雷伯菌肺炎模型組和對照組給予等量的生理鹽水，連續給藥7 d后進行后續實驗。

1.2.3HE染色觀察病理變化 連續給藥7 d后用10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后腹主動脈取血致死，開胸取肺組織，左肺用4%的多聚甲醛4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脫水10 min。酒精脫水機中脫水，然后進行石蠟包埋切片，按照HE染色液說明書進行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4TUNEL染色檢測細胞凋亡 石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20～37℃下孵育15～30 min。PBS漂洗后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，再用PBS漂洗3次。然后按照試劑盒說明書進行生物素標記，顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照，細胞核呈棕色顆粒的為凋亡細胞。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子水平 肺部組織于含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上勻漿，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行炎癥因子水平檢測。首先樣品加入反應孔后37℃孵育45 min，洗滌液洗滌4次。然后加入生物素標記的抗體，37℃反應30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP，混勻后37℃反應30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min，再加終止液終止反應，450 nm處檢測吸光值。

1.2.6流式細胞儀檢測外周血CD14陽性細胞的比例 收集各組大鼠的外周血，加入紅細胞裂解液,靜置20 min,300 g離心5 min,去上清,用PBS清洗后制成1×106個/ml的單細胞懸液。然后加入熒光標記的單克隆抗體PE-CD14抗體，室溫避光孵育30 min。然后PBS洗滌離心，再用10 g/L的多聚甲醛重懸細胞，放入流式細胞儀進行檢測，用SSC和PE-CD14為橫、縱的點圖檢測出CD14的陽性細胞比例。

1.2.7蛋白印跡檢測蛋白水平 肺部組織于含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上勻漿后100℃變性5 min。然后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育。再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照，統計灰度值計算相對表達量。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，各組間進行單因素方差分析后再進行Duncan′s multiple ramge test檢驗。P<0.01為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1諾米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變 通過HE染色觀察諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變的影響。圖1顯示，對照組大鼠肺組織中可見形態不規則、大小不等的管腔和空泡樣結構，肺泡結構受到一定程度的破壞，氣腔擴大，呈現輕微的肺氣腫性肺退行性變化。沒有纖毛上皮細胞壞死脫落、炎性細胞浸潤等病理學改變。模型組大鼠肺組織結構受損，肺泡失去含氣狀態，充滿大量纖維素和紅細胞，部分肺泡融合，肺實質及支氣管壁大量炎性細胞浸潤，纖毛上皮壞死、脫落。諾米林(10、25 mg/kg)組大鼠肺部組織可見含氣的空泡腔，氣腔擴大，肺泡及管內可見少量炎性細胞浸潤，但較模型組好轉。諾米林(50 mg/kg)組大鼠肺部組織可見含氣的肺泡腔，氣腔擴大，氣管黏膜上皮排列整齊，無明顯的炎性細胞浸潤。上述結果表明，諾米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變。

2.2諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細胞凋亡 利用TUNEL染色檢測細胞凋亡，分析諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細胞凋亡的影響。如圖2所示，模型組大鼠肺部組織細胞凋亡高于對照組(P<0.01)。諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠肺部組織細胞凋亡低于模型組(P<0.01)。由此可見，諾米林可減弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細胞凋亡。

2.3諾米林可減輕克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織炎癥反應 為分析諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠炎癥反應的影響，通過ELISA檢測肺部組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平。由圖3可知，模型組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降(P<0.01)。以上結果說明，諾米林可減輕克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織炎癥反應。

圖1 HE染色觀察肺部組織病變Fig.1 Pathological changes of lung tissues were observed by HE staining

圖2 TUNEL染色檢測細胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by TUNEL stainingNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

圖3 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.3 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

圖5 蛋白印跡檢測TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達Fig.5 Expression of TLR4/NF-κB pathway related proteins were detected by Western blotNote：*.P<0.01 vs.control group；#.P<0.01 vs.Klebsiella model group.

圖4 流式細胞術檢測外周血中CD14陽性細胞比例Fig.4 CD14 positive cell rate in peripheral blood was tested by flow cytometryNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

2.4諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14陽性細胞的比例 通過流式細胞分選技術分析諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量的影響。圖4顯示，模型組大鼠外周血中CD14陽性細胞數比例高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠外周血中CD14陽性細胞數比例降低(P<0.01)。上述結果表明，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14陽性細胞的比例。

2.5諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織TLR4/NF-κB 炎癥通路的影響 為分析諾米林對克雷伯菌老年肺炎大鼠TLR4/NF-κB 炎癥通路的影響，蛋白印跡檢測肺部組織CD14、TLR4、NF-κB P65和p-P65的蛋白水平。如圖5所示，模型組大鼠CD14和 TLR4表達及p-P65/P65蛋白比值高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg) 組大鼠CD14和 TLR4表達及p-P65/P65蛋白比值下降(P<0.01)。由此可見，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織CD14和 TLR4表達及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化。

3 討論

目前對細菌性肺炎患者一般采用抗生素經驗性治療，如用β-內酰胺聯合大環內酯類藥物，呼吸氟喹諾酮類原料藥或四環素；或者選者一些新的抗菌藥物，如替加環素和頭孢洛林。然而隨著抗生素的廣泛使用，各種耐藥菌株也不斷增加， 且產生超廣譜酶，這給醫生在選擇抗生素方面提出了很大挑戰[7]。挖掘肺炎新的有效的治療方法已成為研究熱點。越來越多的研究表明植物提取物在各種疾病治療中發揮著積極作用。

大量文獻報道植物提取物具有改善各種疾病中組織病變的功效。有數據顯示草木犀提取物可改善盲腸結扎穿孔術誘導的肺損傷大鼠水腫及炎性細胞浸潤等病理變化[8]。Sohn等[9]發現香芋提取物可減輕H1N1病毒誘導的急性肺損傷小鼠肺部組織炎性細胞浸潤及杯狀細胞增生等病變。有研究顯示檸檬苦素可緩解D-半乳糖胺誘導的肝損傷大鼠肝臟組織門靜脈單核細胞浸潤、組織水腫、纖維化等病理變化[10]。據報道黃柏酮可改善博來霉素誘導的小鼠肺組織纖維化及炎性細胞浸潤等病變[11]。本研究利用老年大鼠克雷伯菌肺炎模型，發現諾米林可減輕肺泡破壞、炎癥細胞浸潤、纖毛上皮壞死脫落，從而改善肺炎病理改變。

肺炎過程中常常會出現細胞凋亡的增加[12]。越來越多的數據表明植物提取物可逆轉各類疾病中異常的細胞凋亡。有研究發現非洲桃花心木的檸檬苦素類化合物可抑制對乙酰氨基酚誘導的肝細胞凋亡，發揮肝細胞保護的作用[13]。據報道兒茶的樹皮提取物可減弱苯并芘誘導的肺毒性小鼠Bax和Caspase-3表達，提高Bcl-2表達，抑制細胞凋亡[14]。有數據顯示在缺血再灌注大鼠中，檸檬苦素可降低Caspase-3的活性[15]。本文結果表明，諾米林可減弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細胞凋亡。

炎癥反應的增強是各類疾病的常見特征，大量研究表明許多植物提取物具有抗炎功效。Ahmad等[16]發現葡萄籽原花青素提取物可抑制卡拉膠誘導的小鼠肺部組織ICAM-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表達。據報道在香煙煙霧冷凝物聯合脂多糖誘導的小鼠肺部炎癥模型中，蛇床子提取物可降低TNF-α、IL-6和MIP-2的水平[17]。有數據顯示葛杜寧減弱酵母聚糖誘導的關節炎小鼠TNF-α、IL-6和PGE2表達[18]。有研究表明印楝素可降低角叉菜膠誘導的足腫脹小鼠TNF-α的表達[19]。據報道諾米林可減弱TNF-α誘導的人主動脈平滑肌細胞IL-1β、IL-4和 IL-6的釋放[20]。Pratheeshkumar等[21]發現諾米林可抑制黑色素瘤荷瘤小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。本研究結果顯示，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平，緩解炎癥反應。

TLR-4/NF-κB通路在各類疾病的炎癥反應中具有重要的調控作用[22]。有研究表明LPS可激活急性肺損傷小鼠中肺臟的氣道上皮和肺泡隔膜細胞TLR-4通路，肺臟中的巨噬細胞會分泌各種炎性細胞因子導致炎癥反應的增強,越來越多的文獻報道植物提取物可調節TLR-4/NF-κB通路[23,24]。有研究發現隱丹參酮可減弱脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞CD14和TLR4的表達[25]。黃杞苷可降低脂多糖誘導的子宮內膜炎小鼠TLR4和細胞核內NF-κB P65水平，抑制NF-κB通路活化[26]。Yang等[27]發現黃芪提取物可抑制卵清蛋白誘導的支氣管哮喘小鼠NF-κB通路活化。據報道葛杜寧可通過TLR-4介導的信號通路降低脂多糖誘導的小鼠炎癥反應[28]。本文結果顯示，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量，減弱肺部組織CD14和 TLR4表達及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化。

綜上所述，在克雷伯菌老年肺炎大鼠模型中，諾米林可改善肺部組織病變，減弱細胞凋亡，抑制IL-6,IL-1β和TNF-α水平，降低外周血中CD14含量，減弱肺部組織CD14和 TLR4表達及NF-κB P65磷酸化水平。諾米林還可通過抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化緩解克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變、細胞凋亡及炎癥反應。下一步將研究諾米林對其他類型的肺炎如病毒性肺炎的影響，為肺炎的治療提供參考。