免疫學實驗教學中小鼠腹腔巨噬細胞化學染色實驗方案改革的探索

王艷玲 李 哲 付海英

(吉林大學基礎醫學院,長春130021)

醫學免疫學是生命科學和醫學領域中具有較為完整的理論體系和技術體系的一門學科，是醫學生的必修課程[1，2]。免疫學理論的主要內容是免疫系統的組成及功能，其中組成包括固有免疫和適應性免疫系統，相應的其功能為固有免疫應答和適應性免疫應答。免疫學實驗課是免疫學教學的重要組成部分，是幫助學生理解基礎知識、培養學生實踐動手能力、提高學生綜合素質的重要平臺，對于培養學生的實踐能力、科研思維等方面具有不可或缺的作用[3]。如何將實驗課程與理論課程相聯系，系統全面的培養學生對課程整體內容的理解一直是我們關注的重點。

在以往的實驗課中，我們一直注重將實驗課教學內容與理論內容緊密結合，分別檢測固有免疫系統(如巨噬細胞等)和適應性免疫系統(如T、B淋巴細胞)的功能，以便于學生對理論知識的理解和鞏固。然而多年教學中，在檢測固有免疫系統中的巨噬細胞時，我們所采用的免疫細胞化學染色試驗遇到了諸多的問題。為此，我們嘗試采用自主制備多克隆抗體進行巨噬細胞的檢測，得到了較好的效果。本文主要就前期存在的問題和改進的設想、方法的實施及成效進行闡述。

1 存在的問題和改進的設想

免疫細胞化學染色試驗是用于檢測免疫細胞數量及功能的常用方法。然而，在嘗試開展小鼠腹腔巨噬細胞化學染色實驗中出現了很多問題，從而影響了教學效果。主要包括以下幾方面的問題:(1)檢測靶點單一導致免疫染色效果不理想：實驗中我們以抗小鼠巨噬細胞上的CD68分子為靶點，通過購置的抗CD68的單克隆抗體進行免疫細胞化學染色。由于該抗體只針對巨噬細胞上的一個分子標志，因此往往顯色不明顯，不易觀察到陽性染色結果，不利于學生對實驗結果進行準確判斷。

(2)重復性差，結果不穩定：由于每學期課上使用的抗體往往來自于不同的生產批次，甚至有時是不同廠家，這導致了每次使用的抗體可能存在效價的不同，因此每次開課前實驗教師都需提前進行多次預實驗，以確定實驗的條件，包括試劑的用量、反應的時間等。但仍常出現結果不穩定、重復性差等缺點，消耗了大量時間、人力、物力。

(3)成本較高：實驗中選用的單克隆抗體，若選擇進口抗體，效價比較高，并且檢測效果也較理想，然而價格相對較高，而且采購周期較長，有時還可能影響正常課程進行。若選擇國內廠家生產的抗體，其價格相對進口抗體低，但是抗體效價通常也比進口抗體低數倍以上，實驗結果往往不理想，嚴重影響教學效果。

由此，我們設想能否自主研制針對巨噬細胞多種表位的多克隆抗體，以解決單克隆抗體的上述問題。

2 方法的實施

我們嘗試以免疫學抗體制備的知識為基礎，分離獲得小鼠腹腔巨噬細胞作為免疫原，通過免疫家兔后收集血清，作為多克隆抗體，并用于小鼠腹腔巨噬細胞的免疫細胞化學染色試驗，進行檢測評價效果。具體的制備過程見圖1。

(1)分離小鼠腹腔巨噬細胞:收集3～5只小鼠腹腔滲出液，經生理鹽水洗滌離心后，置6孔細胞培養板培養2 h后，棄去上清，胰酶消化貼壁細胞，用APC-anti-F4/80抗體標記后流式細胞儀檢測其純度達94%(圖2)，其余細胞收集備用。

圖1 抗小鼠巨噬細胞多克隆抗體的制備流程Fig.1 Preparation of polyclonal antibody against mouse macrophages

(2)免疫家兔:實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性決定著制備出的免疫血清效價的高低[4]，因此我們選擇家兔作為免疫對象，將收集獲得的巨噬細胞與完全弗氏佐劑混合后，多點皮下注射至家兔體內，2 ml/只。初次免疫2周后，進行加強免疫，方法同初次免疫。加強免疫一周后進行肌肉注射再次免疫，分別在四肢進行，2 ml/只。

(3)分離血清:肌肉注射次日，頸動脈取血，室溫靜置2 h后，放4℃冰箱過夜，收集自然析出的血清，2 000 r/min離心10 min，收集上清(含抗小鼠巨噬細胞的多克隆抗體)。

(4)效價檢測:取適量獲得的血清進行不同濃度稀釋，進行小鼠腹腔巨噬細胞免疫細胞化學染色試驗，具體步驟見圖3。

圖2 小鼠腹腔巨噬細胞分離純度檢測鑒定Fig.2 Purity of isolated mouse peritoneal macrophageNote：A.Negative control；B.Macrophages labeled with PE-anti-F4/80.

圖3 小鼠腹腔巨噬細胞免疫細胞化學染色實驗步驟Fig.3 Protocol of immunocytochemical staining of mouse peritoneal macrophages

圖4 兩種抗體進行免疫細胞化學染色效果的對比Fig.4 Comparison of immunocytochemical staining effects between two antibodiesNote：A,D,F.Result of serial diluted commercial monoclonal antibody detection(1∶500,1∶1 000,1∶2 000)；B,E,G.Result of serial diluted homemade polyclonal antibody detection(1∶500,1∶1 000,1∶2 000)；C.Result of negative control.

3 改革成效

運用該方法取得了較好的檢測結果，并且該方法具有以下幾方面的優勢。(1)檢測陽性率高：與前期單克隆抗體檢測結果進行比較，采用改良免疫細胞化學染色實驗檢測小鼠腹腔巨噬細胞的實驗結果，顯示自制的多克隆抗體能明顯增加細胞陽性染色比例，且染色更加明顯(圖4)，利于結果觀察和判斷。并且采用自制的多克隆抗體稀釋至2 000倍后仍能檢測到巨噬細胞，而當商品化單克隆抗體稀釋至該濃度時幾乎無法檢出(圖3)。

(2)制備簡單、來源方便:與單克隆抗體制備流程相比，多克隆抗體的制備相對簡單，只需要獲取免疫原，即小鼠腹腔巨噬細胞，進而免疫家兔后分離血清即可，不需要制備雜交瘤細胞及篩選單克隆細胞株等繁瑣的過程，大大縮短了抗體的制備周期。

(3)成本降低、易于推廣:采用改革后的方案，只需準備數只小鼠和家兔，自行操作即可獲得實驗用多克隆抗體。由于家兔體積較大，采血量多，因此免疫一只家兔即可獲得足夠量的抗體用于實驗課。課前無需再購置價格昂貴的單克隆抗體，大大節約了實驗成本。避免了商品化抗體采購周期長的問題，保證了抗體能及時應用于教學。

綜上所述，此改良方法流程簡單、容易操作，且不需要特殊的儀器和設備，只需能夠進行實驗動物操作和血清分離的實驗室即可完成；結果判定簡單，僅需普通光學顯微鏡下觀察即可，因此可在大多數基礎實驗室推廣開展。

4 結語

我們嘗試了以小鼠腹腔巨噬細胞為抗原，通過免疫家兔，收集血清獲得了抗小鼠腹腔巨噬細胞的多克隆抗體，并以此替代單克隆抗體進行免疫細胞化學染色試驗，得到了較好的實驗效果，相對于以往實驗結果不穩定導致學生學習熱情較低，改良后的方法可大大提高學生的興趣，該方法可推廣用于免疫學實驗課的教學中，為在醫學院校免疫學實踐課中開展巨噬細胞的檢測提供了必要的手段。