固相萃取-反相高效液相色譜法對(duì)潑尼松龍片劑有效含量的測(cè)定

張 慧

（浙江仙琚制藥股份有限公司，浙江 仙居 317300）

潑尼松龍 （Prednisolone），化學(xué)名 11β,17α,21-三羥基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，為潑尼松的一種活性代謝產(chǎn)物，是一種合成用副腎皮質(zhì)荷爾蒙制劑，具有抗炎、抑制免疫、抗病毒和抗休克等功效而廣泛用于臨床治療。目前國(guó)內(nèi)對(duì)潑尼松龍的檢測(cè)報(bào)道很多[1-3]，檢測(cè)方法也較為成熟，針對(duì)不同的樣品有不同的前處理方法。食品化妝品等復(fù)雜基質(zhì)的殘留潑尼松龍大都采用固相萃取技術(shù)凈化和濃縮[3-4]，而藥物類基質(zhì)樣品的潑尼松龍殘留采用有機(jī)溶劑溶解后直接進(jìn)樣[5]，并未采用固相萃取技術(shù)，因而不易凈化，容易產(chǎn)生基質(zhì)干擾。固相萃取技術(shù)作為一種高效實(shí)用的前處理技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品等的檢測(cè)。本文擬將固相萃取技術(shù)用于藥物類基質(zhì)中的潑尼松龍殘留提取與凈化，然后用反相高效液相色譜檢測(cè)。該方法不易產(chǎn)生干擾，重復(fù)性好，靈敏度高，可用于原料藥及藥品中潑尼松龍及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)Agilent公司1100型液相色譜儀，配在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及紫外檢測(cè)器（VWD）。高純水發(fā)生器（Milli-Q，美國(guó)MILLIPORE公司）。高速冷凍離心機(jī) (Sigma 3k-30)。氮吹儀 (N-EVAP111，美國(guó)Organomation公司)。Oasis HLB固相萃取柱(6mL，150mg，美國(guó)Waters公司)，使用前分別用5mL甲醇和5mL水活化。潑尼松龍標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma-Aldrich公司，純度＞98%）。甲醇色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，其他試劑為分析純。

1.2 溶液配置

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取潑尼松龍標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g(準(zhǔn)確至0.0001g)，用甲醇溶液定容到10mL，配置成濃度為1.0mg/mL的儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱保存。臨用時(shí)用流動(dòng)相稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液液 (pH=5.2)：吸取5.72mL冰乙酸至500mL容量瓶，定容到刻度。稱取27.22g三水乙酸鈉，用水溶解后定容到1000mL容量瓶。分別量取上述溶液21mL和79mL混合，用乙酸調(diào)pH值到5.2。

1.3 色譜條件

色譜柱為 C18(Inertsil ODS-SP 5μm 4.6×150mm，日本島津)；保護(hù)預(yù)柱為C18(Eclipse XDB 5μm 4.6mm×12.5mm，美國(guó) Agilent)；流動(dòng)相：甲醇/0.1%甲酸水溶液 (體積比為60/40)，流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)247nm，進(jìn)樣量10μL。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 樣品

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.1g研磨好的藥品試劑 (精確到0.01g)于15mL離心管中，依次加入2mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、3mL甲醇充分震蕩混勻，用離心機(jī)在4℃1000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)入15mL離心管待凈化。重復(fù)上述過程，合并上清液，用甲醇定容到10mL。取活化好的HLB固相萃取小柱，準(zhǔn)確吸取1mL上述待凈化液體以1mL/min的流速上樣，然后依次用5mL水，3mL 30%甲醇淋洗，棄去全部淋洗液，減壓抽干。用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用色譜流動(dòng)相定容到10mL,過0.45μm濾膜供液相色譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性相關(guān)性及其檢測(cè)限

將質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的儲(chǔ)備液恢復(fù)到室溫，用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為100μ/mL的工作液。上述工作液用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為10、30、50、80和100μg/mL的工作曲線，在上述色譜條件下檢測(cè)。潑尼松龍的線性方程為Y=-18.2563+15.2520×X，相關(guān)系數(shù)r=0.99919。最低檢出限為1mg/g(S/N=3)。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

由于潑尼松龍片劑含有大量淀粉和乳糖等，會(huì)形成基質(zhì)干擾，必須對(duì)其進(jìn)行凈化處理。按照傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，本研究采用固相萃取技術(shù)來凈化。以市售潑尼松龍片為樣品基質(zhì)，采用HLB SPE小柱的凈化。結(jié)果顯示，采用HLB小柱的回收率為 87.4%～93.7%。將提取液上柱后，分別采用1、2、3和4mL甲醇進(jìn)行淋洗。結(jié)果表明，采用2mL甲醇洗脫回收率最優(yōu)，淋洗體積繼續(xù)增加，回收率沒有顯著變化。

2.3 方法的精密度和回收率

在不含潑尼松龍片劑的空白基質(zhì) (含淀粉、乳糖等)上添加質(zhì)量濃度為10.0mg/g、20.0mg/g和50.0mg/g的質(zhì)量濃度水平，各平行3次，計(jì)算其回收率，結(jié)果表明回收率范圍在87.4%～93.7%，見表1。

表2 潑尼松龍片加標(biāo)回收試驗(yàn) (n=9)

2.4 討論

采用固相萃取技術(shù)來凈化潑尼松龍片劑中雜質(zhì)，富集潑尼松龍化合物，然后用液相色譜檢測(cè)潑尼松龍的濃度。通過優(yōu)化淋洗體積優(yōu)化萃取條件，使回收率達(dá)到87.4%～93.7%。同時(shí)建立液相色譜分析條件，最低檢出限達(dá)到1mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法雜質(zhì)干擾少，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單快捷，可用于藥品中潑尼松龍的定性定量檢測(cè)。