表皮生長因子對抗NMDA受體腦炎致海馬神經元損傷的保護作用

李振宏

[摘要] 目的 研究表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）干預治療抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷的保護作用及機制，為抗NMDA受體腦炎提供新的治療靶點。 方法 建立抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型，當神經元細胞培養至第8天，將實驗組分為1﹑2 d和3 d 3個時相點， 每個時相點15個標本，在實驗組中加入EGF（10 ng/mL），應用臺盼藍染色法、免疫組織化學和TUNEL細胞凋亡檢測等技術， 檢測EGF對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用以及細胞凋亡基因caspase-3表達水平變化。 結果 當谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率高[（2.2 ±1.014）%、（3.3±0.975）%]，而細胞存活率并不低[（77.6±5.039）%、（73.4±4.969）%];在誘導神經元凋亡實驗中，凋亡后3 d內，3組細胞的神經元細胞存活率相互比較，差異有統計學意義（P<0.05）;3組細胞的神經元凋亡率相互比較，差異有統計學意義（P<0.05）;3組細胞的caspase-3基因陽性表達率相互比較，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論EGF對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷有保護作用，可能是EGF通過促使凋亡基因caspase-3表達減少，抑制神經元凋亡發生，從而對抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷起到保護作用。

[關鍵詞] 抗NMDA受體腦炎;神經元;損傷;表皮生長因子

[中圖分類號] R742 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2019）02（b）-0047-05

Protective Effect of Epidermal Growth Factor on Hippocampal Neuronal Injury Induced by NMDA Receptor Encephalitis

LI Zhen-hong

Department of Pediatrics， Ganzhou Hospital Affiliated to Nanchang University， Ganzhou， Jiangxi Province， 341000 China

[Abstract] Objective To study the protective effect and mechanism of epidermal growth factor （EGF） intervention on anti-NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury， and provide a new therapeutic target for anti-NMDA receptor encephalitis. Methods A neuronal injury model induced by anti-NMDA receptor encephalitis was established. When the neuron cells were cultured until day 8， the experimental components were divided into three phases， one day， two days and three days， each phase point 15 samples. In the experimental group， EGF（10 ng/mL） was added to the experimental group， and the protective effect of EGF against NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury was detected by trypan blue staining， immunohistochemistry and TUNEL apoptosis detection. And the expression level of the apoptosis gene caspase-3 was changed. Results When the concentration of glutamic acid was 100， 200 μmol / L， the apoptotic rate was high [（2.2± 1.014）%，（3.3±0.975）%]， while the cell survival rate was not low [（77.6±5.039）%，（73.4±4.969）%]; in the induction of neurons of the apoptosis experiment， the neuronal cell survival rates of the three groups were compared within 3 days after apoptosis， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The neuronal apoptosis rates of the three groups were compared with each other. the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive expression rates of caspase-3 gene in the three groups were compared with each other， and the statistical the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion EGF has a protective effect against neuronal damage caused by NMDA receptor encephalitis. It may be that EGF inhibits neuronal apoptosis and playing a protective role in inhibiting the expression of caspase-3 and inhibiting neuronal damage induced by NMDA receptor encephalitis.

[Key words] Anti-NMDA receptor encephalitis; Neurons; Injury; Epidermal growth factor

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA） 受體腦炎是一種起病時臨床表現不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經系統疾病[1]。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是Cohen[2]于1962年發現的一種可促進人體細胞生長的營養因子，由多個氨基酸編碼組成，在正常人體內表皮生長因子含量較少。隨著醫學生物技術的不斷提高，現在國內外已能大量生產人表皮生長因子。該研究針對抗NMDA受體腦炎的發病機制，通過建立抗NMDA受體腦炎體外培養模型， 當神經元細胞培養至第8天，將實驗組分為1﹑2 d和3 d 3個時相點， 每個時相點15個標本，觀察EGF對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用，了解EGF對神經元的作用和機制， 為抗NMDA受體腦炎的臨床研究提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇剛出生的SD大鼠培養原代神經元細胞， 把原代神經元細胞分3組（實驗組﹑對照組和正常組），每組分1﹑2 d和3 d 3個時相點， 每個時相點15個標本。

1.2 方法

1.2.1 原代神經元培養 選擇剛出生的SD大鼠，用眼科鑷取出海馬，D-Hanks液清洗后，剪成1 mm3左右的小塊，在37℃溫度下用0.25%胰蛋白酶消化組織小塊后， 調節細胞懸液濃度為1×106/mL， 接種于經0.01%多聚賴氨酸預處理的細胞培養瓶中。在神經元培養第9天， 經過神經微絲-200免疫組織化學法鑒定， 神經元細胞占培養細胞的90%以上。

1.2.2 建立抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型當神經元細胞培養至第9天，將神經元分為谷氨酸實驗組及正常對照組，谷氨酸濃度分別為100 、200 、300 、400 μmol/ L 。正常對照組不加入任何藥品處理，實驗組中不同濃度的谷氨酸與神經元細胞作用15 min后更換新鮮培養液， 24 h后進行臺盼藍染色和TUNEL細胞凋亡檢測。

1.2.3 臺盼藍染色檢測細胞存活率神經元細胞 經臺盼藍法染色后，隨機選取15個視野，計數藍染神經元數，死亡細胞被染成藍色， 未著色的細胞為存活細胞。神經元存活率（%）=（實驗組神經元存活數/細胞總數） ×100%。

1.2.4 TUNEL檢測細胞凋亡率 神經元細胞經TUNEL檢測，隨機選取15個視野，計數深棕色神經元數，凋亡細胞被染成深棕色， 未著色的細胞為存活細胞。神經元凋亡率（%）= （實驗組神經元凋亡數/細胞總數） ×100%。

1.2.5 凋亡基因Caspase-3表達檢測 采用免疫組織化學方法，隨機選取15個視野，計數陽性神經元數和總神經元數， 陽性神經元為細胞中有棕色著色者， 凋亡基因caspase-3陽性表達率（%）= （陽性神經元數/神經元總數） ×100%。

1.2.6 EGF對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用 把神經元分為實驗組﹑對照組和正常組共3組，每組分1﹑2 d和3 d三個時相點， 每個時相點15個標本。實驗組在加谷氨酸前1天加入EGF （10 ng/mL）， 對照組中加入相同劑量緩沖液， 正常組不作處理。

當神經元細胞培養至第9天， 將低濃度谷氨酸（100 μmol/L）加入實驗組和對照組中，15 min后換回正常細胞培養液， 正常組不加入谷氨酸。繼續培養細胞至1﹑2 d和3 d進行細胞存活率、凋亡率和凋亡基因檢測。

1.2.7 統計方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行3組細胞數據分析，以均數±標準差（x±s）表示計量資料， 兩組間進行t檢驗分析，多組間比較采用方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）

2 結果

2.1 神經元細胞培養及鑒定神經元接種

在細胞培養瓶后，可見神經元為懸浮在始建于培養液中的圓形細胞，， 細胞密度很高。1 d后在培養瓶壁上可見大多數神經元基本貼壁， 少數神經元可見軸突生長， 軸突長度約占細胞體的一半， 2 d后大多數神經元有軸突生長，長度約為胞體的2～3倍，3 d后神經元細胞胞體變大，軸突長度增長不明顯， 第4～5天可見許多細胞碎片，為崩解的神經膠質細胞， 培養第8天，軸突逐漸增長， 彼此相互連接， 形成網狀（照片1）。

細胞培養第9天， 免疫組織化學鑒定神經元， 神經元細胞及其軸突被染成棕色，棕色陽性細胞占全部細胞的90%以上（照片2）。

2.2 抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型

2.2.1 細胞存活率 比較不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞6 h后，可見部分細胞胞體腫脹，細胞軸突變短;1 d后部分腫脹細胞裂解。采用臺盼藍染色法計算神經元存活率，結果發現各種濃度的谷氨酸都能誘導神經元細胞死亡，各種濃度的谷氨酸組神經元細胞與對照組神經元細胞比較，差異有統計學意義（P<0.01） ，而且隨著實驗組谷氨酸濃度逐漸升高，神經元細胞的存活率也逐漸下降（照片3）。

2.2.2 細胞凋亡率 比較TUNEL染色發現，不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞1 d后，神經元細胞體積變小，細胞核固縮。各種濃度的谷氨酸都能誘導神經元凋亡，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），在谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/ L時，神經元凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而上升，在谷氨酸濃度為200﹑300﹑400 μmol/ L時，細胞凋亡率隨著濃度的上升而下降（照片4）。相關數據見表1、圖1、圖2。

2.3 EGF對神經元的保護作用

2.3.1 細胞凋亡檢測 在神經元細胞培養第9天，使用100 μmol/L谷氨酸誘導神經元凋亡后，通過TUNE方法檢測， 結果顯示：凋亡后第1天， 正常組的神經元凋亡率為0.8%， 較實驗組細胞（1.4%）和對照組細胞（2%）明顯下調，差異有統計學意義（P<0.05）;實驗組細胞與對照組細胞比較， 統計學比較差異有統計學意義（P<0.05）。細胞凋亡后第2天，正常組的神經元凋亡率為1.1%，較實驗組細胞（2.2%）和對照組細胞（5.4%）明顯下調， 差異有統計學意義（P<0.05）;實驗組細胞與對照組細胞統計學比較，差異有非常顯著性意義（P<0.01）。凋亡后第3天，正常組的神經元凋亡率為1.4%，較實驗組（3.5%）和對照組（6.2%）明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）;實驗組細胞與對照組細胞比較，差異有統計學意義（P<0.01）（照片5）相關數據見表2、圖3。

2.3.2 神經元存活率檢測 在谷氨酸誘導神經元凋亡后的1﹑2 d和3 d，使用行臺盼藍方法染色， 結果顯示：凋亡后1 d， 正常組的神經元存活率為90.2%，較實驗組（90.2%）和對照組（75.9%）明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組細胞比較， 實驗組細胞存活率明顯上調，差異有統計學意義（P<0.01）。凋亡后第48 h， 正常組的細胞存活率為84.4%，較實驗組（75.3%）和對照組（70.5%）明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組細胞比較， 實驗組細胞存活率明顯增上調，差異有統計學意義（P<0.05）。凋亡后72 h， 正常組的細胞存活率為81.4%，較實驗組（72.3%）和對照組（66.6%）明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組比較， 實驗組存活細胞明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.05）。存著數據見表3、圖4。

2.3.3 凋亡基因Caspase-3表達情況 通過免疫組化技術，檢測凋亡基因caspase-3在神經元中的表達情況，神經元胞漿和軸突著色的為caspase-3陽性細胞。凋亡后第1天， 正常組的caspase-3陽性細胞率為1.3%， 較實驗組（3.6%）和對照組（6.9%）明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組比較， 實驗組caspase-3陽性細胞明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）。凋亡后第2天， 正常組的caspase-3陽性細胞率為2.7%， 較實驗組（5.4%）和對照組（12.2%）明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組比較， 實驗組caspase-3陽性細胞明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）。凋亡后第3天， 正常組的caspase-3陽性細胞率為3.9%， 較實驗組（8.2%）和對照組（13.2%）明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）;與對照組比較， 實驗組caspase-3陽性細胞明顯減少， 差異有統計學意義（P<0.01）（照片6），具體數據見表4。

3 討論

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA） 受體腦炎是一種起病時臨床表現不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經系統疾病，主要累及人體大腦邊緣系統，典型臨床表現以精神異常與癲癇發作為特征，其中大多數患者由腫瘤、感染[1]等引起。目前國內外學者大多數認為該病是抗NMDA抗體介導的免疫損傷所致[3-4]。其中NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，是由多種亞基組成的異四聚體，屬電壓門控通道，大量存在于大腦神經細胞中，其中主要分布在大腦海馬區等邊緣系統，功能主要是調節突觸傳遞及促發突觸重塑，異常激活常導致驚厥發作、精神異常等臨床表現[5-6]。

我們在神經元細胞培養至第10天，當神經元發育成熟，細胞狀態良好時，用不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞。通過TUNEL和細胞存活率檢測，結果表明谷氨酸可使細胞死亡率明顯升高，并且隨著谷氨酸濃度的升高而升高;谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/ L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而升高，而濃度為200﹑300﹑400 μmol/ L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而下降。由于谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/ L時，細胞凋亡率高而細胞死亡率并不高，提示100﹑200 μmol/ L的谷氨酸為誘導神經元凋亡的最合適濃度。我們在使用谷氨酸誘導神經元凋亡的前1 d，在實驗組神經元中加入EGF，然后采用TUNEL檢測和臺盼藍染色等方法來評價EGF對神經元的保護作用。該次的研究結果表明，加入了EGF的實驗組細胞存活率明顯高于對照組，而細胞凋亡率卻明顯低于對照組，提示EGF對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷具有抑制作用，對神經元具有保護作用。而其對神經元的保護作用，可能主要是通過抑制凋亡的途徑來實現的。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用， 其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮作用。caspase-3 正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的caspase-3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[7-8]。在抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的機制中，有無caspase-3的參與，而EGF對其表達有無抑制作用， 為此我們作了caspase-3免疫組化[9-12]。

結果顯示：谷氨酸損傷使caspase-3蛋白表達增加，提示caspase-3參與了抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的機制; 實驗組的caspase-3蛋白表達比對照組明顯減少，并且與細胞凋亡呈高度正相關，提示EGF可抑制caspase-3蛋白表達，因此其抑制凋亡的作用可能與抑制caspase-3蛋白表達有關。

中國全科醫學雜志發表的文章《堿性成纖維細胞生長因子對癲癇致誨馬神經元損傷的保護作用》也做過類似的實驗，采用50 μmol/L的谷氨酸誘導神經元凋亡，在實驗組中加入堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，20 ng/mL），觀察bFGF對損傷神經元存活的保護作用以及caspase-3基因在損傷神經元中的表達情況。在誘導神經元凋亡1 d后，實驗組的細胞存活率（83.8±6.8）%與對照組比較（77.4±6.5）%比較，差異有統計學意義（P< 0.05）;實驗組的細胞凋亡率（1.5±0.7）與對照組比較（2.7±1.4）%比較，差異有統計學意義（P<0.05）;實驗組的caspase-3基因陽性表達率（3.8±1.8）與對照組比較（6.2±3.0）%比較，差異有統計學意義（P<0.05）。與該實驗不同的是，該實驗采用的是濃度為100 μmol/ L的谷氨酸誘導神經元凋亡，誘導神經元凋亡后加入的是EGF，但說明了EGF對損傷神經元也具有保護作用，以及其抑制凋亡的作用可能與抑制caspase-3蛋白表達有關。

綜上所述，該研究提示100μmol/ L谷氨酸可作為抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的良好模型， EGF對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷有保護作用， 可能是EGF通過促使凋亡基因caspase-3表達減少，抑制神經元凋亡發生從而對抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷起到保護作用。

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（收稿日期：2018-11-15）