以曲札茋苷為評價指標的大孔樹脂再生工藝優化

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1.云南中醫學院，云南 昆明 650100；2.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100

大孔樹脂[1]是一種不帶離子交換基團的多孔性高分子材料, 具備較高的比表面積和多孔性 ,通過有選擇性的物理吸附從植物提取液中提取有效成分。大孔樹脂內部是具有三維網狀立體空間孔結構的有機高分子聚合物[2-4]，通過相互交聯聚合反應，制備形成的有機多孔骨架吸附材料[5]。在工業生產中以大孔吸附樹脂為吸附劑，使用適宜的吸附和解吸條件對不同成分進行選擇性吸附、篩選，從而達到分離、純化某一種或一類有機化合物[6]。相比傳統的硅膠色譜，大孔吸附樹脂具有良好的選擇性和吸附性、解吸和再生工藝條件溫和、成本低、使用壽命長、可反復使用等諸多優點[7-13]。因而，這種高效方便的分離技術在許多領域都顯示出它獨特的效果，特別是天然藥物分離活性成分方面，主要用于植物活性成分的分離純化。

通常情況下，大孔樹脂在重復多次使用后，會因吸附物質的增加使柱效降低，引起樹脂中毒，因此需要以酸堿強化再生[14-15]。對于D 101大孔吸附樹脂再生工藝已有部分研究，但對于 ADS-7 大孔樹脂的再生工藝研究還未見報道，并且到目前為止，還沒有一種簡單、便捷、成本低、環境污染少且能完全恢復樹脂吸附脫附性能的方法[16]。故本實驗在已有的曲札茋苷純化工藝基礎上，進一步優化D 101 型大孔樹脂(非極性)和 ADS-7 型大孔樹脂(中極性)的再生方法，為后續生產研究提供參考。

1 實驗試劑、試藥與儀器

R-220 SE 旋轉蒸發儀(Buchi)；低溫冷卻液循環泵(DLSB-30L / 20)；美國戴安 U 3000 型高效液相色譜儀；梅特勒 XP-205 型分析天平。拉薩大黃藥材(批號：20131217)購自西藏墨竹工卡縣，由中科院昆明植物所劉恩德鑒定為蓼科植物拉薩大黃(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao)；乙醇為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純(德國默克公司)；D101 型大孔樹脂、ADS-7 型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；全部實驗用水均為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 COSMOSIL packed column(4.6 I.D.×250 mm)；檢測波長：319 nm；流速：1.0 mL/min；以0.1 % 乙腈為流動相A，0.1%磷酸水為流動相B；梯度洗脫；取10 μL，注入液相色譜儀。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱取曲札茋苷約20 mg，置100 mL 量瓶中，加75% 甲醇溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；分別精密吸取該貯備液加75% 甲醇溶液稀釋至刻度，配制濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、6 μg/mL、4 μg/mL的曲札茋苷溶液，搖勻，分別取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將峰面積(A)對曲札茋苷濃度(C)作線性回歸，得回歸方程為：A=9647.2C-7050.8，R2=0.999。表明曲札茋苷在4～200 ug/mL范圍內峰面積與濃度線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗 分別配置不同濃度(200、100、40 μg/mL)的曲札茋苷溶液，按上述色譜條件測定6 次，記錄峰面積，RSD分別為0.53%、0.62% 、0.29%，均小于 2%。

2.2.3 穩定性試驗 精密稱取曲札茋苷適量，置于容量瓶中，加75% 甲醇溶解，配置成濃度為40 ug/mL，搖勻。在0、2、4、8、12、24 hr分別取10 uL，注入液相色譜儀，記錄主峰面積，RSD為0.47 %，小于2 %。

2 實驗方法

2.1 大孔樹脂上樣液的制備

2.1.1 D101 大孔吸附樹脂上樣液 取 200 g 藥材于 3 L 圓底燒瓶中，加95%乙醇 1.6 L ，熱回流提取2 h，共提取3次，合并濾液。將濾液回收至流浸膏，加 200 mL水靜置 24 h，取上清即為 D101 大孔樹脂上樣液。

2.1.2 ADS-7 大孔吸附樹脂上樣液 取 400 mL的D101樹脂裝柱，使其徑高比為 1∶8，取 100 mL上樣液以1 BV / h 的流速上樣，靜置2 h，之后以4 BV / h 的流速用水洗脫4 BV，繼用 25% 乙醇洗脫6 BV，收集第 2～6 BV洗脫液，將洗脫液濃縮至無醇即為 ADS-7 大孔樹脂的上樣液。

2.2 樹脂的再生

2.2.1 正交試驗優化樹脂再生條件 樹脂再生方法：在容器內加入高于樹脂層10 cm的2%～3%HCl溶液浸泡2～4 h，然后用3倍于樹脂體積的HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH值接近中性；繼用5% NaOH溶液浸洗2～4 h，并同上法用3倍于樹脂體積的5% NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH值為中性，最后用2～3倍樹脂體積的乙醇洗柱，再純水洗去乙醇。乙醇洗脫倍數則進行單因素考察,分別用 95 % 乙醇洗脫 2、3 BV，通過對比樹脂吸附量進行最佳洗脫倍數的篩選。

根據上述方法，本試驗將進一步對 HCl 溶液濃度(A)、HCl 溶液浸泡時間(B)、NaOH溶液濃度(C)、NaOH 溶液浸泡時間(D)4 個因素進行優化篩選，每個因素選擇 3 個水平進行 L9(34)正交設計，結果見下表 1。

表1 樹脂再生工藝因素水平

以樹脂處理后大孔樹脂的靜態吸附量為評價指標，來篩選 D101 型及 ADS-7 型大孔樹脂再生的工藝條件。具體方法為：分別取 5 mL 樹脂于燒杯中(新樹脂作為對照)，倒入 10 mL的上樣液，室溫下放置 24 h，抽取上清液進行 HPLC 檢測；取 5 mL 再生后的 ADS-7樹脂于燒杯中(新樹脂作為對照)，倒入 50 mL 的上樣液，室溫下放置 24 小時，抽取上清液進行 HPLC 檢測，并對曲札茋苷吸附量進行計算。

3 結果

3.1 D101樹脂再生試驗結果

3.1.1 正交試驗結果 采用L9(34)正交試驗進行正交試驗篩選，結果見表2，并對大孔樹脂的吸附量進行方差分析，結果見表3。通過極差R分析顯示，影響樹脂對曲札茋苷吸附量的因素依次為D>A>C>B，四個影響因素無顯著性意義，以A2B1C1D1為佳，即用3%鹽酸溶液浸泡2 h，2 % 氫氧化鈉浸泡2 h。

表2 D101大孔樹脂再生正交試驗結果

表3 D101大孔樹脂吸附量方差分析表

注：F0.05(2,2)=19,P<0.05。

3.1.2 乙醇洗脫倍數考察結果 在上述酸堿處理的基礎之上，優化D101 樹脂的乙醇洗脫體積，試驗結果見表4。乙醇沖洗2 BV即可將樹脂中殘留的大量有機物沖出，因此選擇乙醇洗脫2 BV即可。

綜上所述，D101樹脂的最佳再生工藝為：在容器內加入高于樹脂層10 cm的3%HCl溶液浸泡2 h，然后用3倍于樹脂體積的3%HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH值接近中性；繼用2% NaOH溶液浸洗2 h，并同上法用3倍于樹脂體積的2%NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH值為中性，最后用2倍樹脂體積的95%乙醇洗柱，再純水洗去乙醇，即可。

表4 D101大孔樹脂乙醇洗脫倍數考察表

3.2 ADS-7樹脂再生試驗結果

3.2.1 正交試驗結果 用 L9(34)正交表進行正交實驗優選，試驗結果見表5，并對大孔樹脂的吸附量進行方差分析，結果見表6。通過極差R分析顯示，影響ADS-7樹脂對曲札茋苷吸附量的因素依次為B>A>D>C，四個影響因素無顯著性意義，以A3B3C3D1為佳，即用5%鹽酸溶液浸泡4 h，用5%氫氧化鈉溶液浸泡2 h。

表5 D101大孔樹脂再生正交試驗結果

表6 ADS-7大孔樹脂吸附量方差分析表

注：F0.05(2,2)=19,P<0.05。

3.2.2 乙醇洗脫倍數考察結果 在上述酸堿處理的基礎之上，優化ADS-7 樹脂的乙醇洗脫體積，試驗結果見表7。乙醇沖洗2 BV即可將樹脂中殘留的大量有機物沖出，因此選擇乙醇洗脫2 BV即可。

表7 ADS-7大空樹脂乙醇洗脫倍數考察表

綜上所述，ADS-7 樹脂的最佳再生工藝為：在容器內加入高于樹脂層10 cm的5% HCl溶液浸泡4 h，然后用3倍于樹脂體積的5%HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH 值接近中性；繼用5% NaOH溶液浸洗2 h，并同上法用3倍于樹脂體積的5 % NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH 值為中性，最后用2倍樹脂體積的95% 乙醇洗柱，再純水洗去乙醇，即可。

3.3 驗證試驗 為進一步驗證再生工藝的可行性，分別另取3份樹脂，每份200 mL，按優化工藝進行重復試驗，結果見表8。

表8 驗證結果

4 討論

本次實驗通過樹脂靜態吸附法，以曲札茋苷量為評價指標，采用 HPLC 測定曲札茋苷的含量，對 D101 和 ADS-7 兩種大孔樹脂再生工藝條件進行正交試驗篩選，和大孔樹脂再生工藝條件中乙醇洗脫倍數的單因素考察，從而得到 D101 型大孔樹脂的最佳再生工藝和 ADS-7 型大孔樹脂的最佳再生工藝。通過實驗驗證，該再生工藝簡單，成本低，且重復性好，有效的提高了樹脂的使用次數，延長了樹脂使用壽命，為大孔樹脂再生工藝的提供了有效的參考數據，可進一步應用于工業化生產中。