蠟質標本制作與保存對沉水植物穩定同位素的影響

李 超 張培育 徐 軍 張 敏

(1. 華中農業大學水產學院, 淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 池塘健康養殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070;2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

數百年來, 植物學家們收集并保存了大量的包含采集日期、地理信息、生境、形態學和物候學特征等信息在內的植物標本[1], 借助歷史采集標本可以分析長期的環境污染和全球變化對植物的影響[2—3]。通過不同年份植物標本花期的對比發現全球變暖將導致植物的花期提前和持續時間的縮短[4—7]。同時, 研究發現植物的春季開花和出芽時間與冬春季的溫度呈負相關關系[8—10]。目前, 相關研究主要通過觀察植物標本的外部形態和物候特征(如株高、葉面積、首次開花時間、花期高峰、落葉和結果時間等)來探究其在長期的環境因素影響下的響應機制[11—14], 因此不能綜合反映植物體應對自然環境變化的響應機制。

通過對長期生態調查研究過程中保存下來的植物標本的碳、氧穩定同位素分析可以揭示全球大氣CO2濃度升高, 以及植物對水分利用情況的變遷[15—18]。植物標本葉片組織中氮穩定同位素含量的下降主要是由在人類影響下全球氮循環受阻, 生態系統中氮元素的沉降增加導致的[19]。水生植物氮穩定同位素, 由于其容易受環境中氮升高而富集,可以用來回溯人類活動造成的水體富營養化發展進程[20—23]。

水生沉水植物作為淡水生態系統中水生植被的重要組成部分之一, 通過對大量水生生物標本穩定同位素的研究分析我們可以了解某一歷史時期水體環境的變化, 并探究沉水植物對不同環境因子改變的響應機制, 是研究水生態系統歷史變遷過程的重要工具。但是, 相對于長期大量的生態調查留下的數目驚人的水生植物標本來說, 相關的穩定同位素研究仍鮮有報道。這可能與植物標本的穩定同位素值易受制作和保存過程的影響而發生變化有關。目前的大量研究都關注于水生動物(尤其是魚類等)制作標本的過程和保存中對其穩定性同位素的影響。研究發現福爾馬林溶液浸泡保存的浮游動物樣品中δ13C和δ15N的值都顯著上升[24], 但是也有研究認為福爾馬林溶液處理的標本中δ13C值呈現下降的趨勢[25]。相關的研究也曾在魚類組織標本中展開[26—28]。但是, 水生沉水植物蠟質標本的制作和保存過程對其穩定同位素值的影響, 還沒有相關的研究報道。

本實驗選取了金魚藻(Ceratophyllum demersum)、穗狀狐尾藻(Myriophyllum spicatum)、馬來眼子菜(Potamogeton malaianus)3種沉水植物, 按照傳統野外的方法制作和保存蠟質標本。通過對沉水植物標本制作和保存階段碳、氮穩定同位素值的測定分析, 為后續利用水生植物標本碳、氮穩定同位素值來研究水生態系統變化的可靠性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2011年11月采集金魚藻、穗狀狐尾藻和馬來眼子菜3種沉水植物, 共計100份植物樣品。其中金魚藻采自武漢東湖(N 30.5567°, E 114.3866°), 穗狀狐尾藻和馬來眼子菜采自中國科學院武漢植物園(N 30.5410°, E 114.4196°)。所有樣品均選取地上部分或整株植株, 后經自來水沖洗干凈, 并小心去除附著藻類。

1.2 蠟質標本制作

為了與以前的傳統野外采集制作標本的方法一致, 我們參照了傳統的制作方法[29,30]。待植物清洗干凈后, 我們使用干凈的未被用作它途的報紙,將植物標本夾在報紙中, 每份標本放置一個標簽,記錄好采樣時間, 采樣地點, 物種名和分組代碼。每種植物, 按照采樣的地點, 分成3—5份。標本用木夾子固定, 放置于陰涼通風處, 前1周每天更換1次報紙, 之后每2天更換1次報紙, 直至標本干燥。然后將標本在飽和的升汞溶液(HgCl2)中浸泡5min,用以殺死標本上的細菌及蟲卵等微生物, 最后將標本保存在標本柜中。

1.3 同位素樣品采集

選取植物葉片組織用于同位素的測定。在制作標本之前, 我們從每種植物樣品中隨機抽取一株,在烘箱中用60℃烘干大于48h至恒重。第一次的鮮樣采集作為對照(Control)。之后再采集1次所有植物干燥后的樣本(Dry)。浸泡過后的樣品采集1次(AS), 然后分別再在保存1周后(1 W)、1個月后(1 M)、2個月后(2 M)、3個月后(3 M)、4個月后(4 M)、5個月后(5 M)和6個月后(6 M)采集一次樣。

1.4 同位素測定

在樣品采集后, 60℃烘干大于6h至恒重。干燥后的樣品用振蕩碾磨儀碾磨至粉末狀供后續測樣。大約3 mg干重的樣品, 被用來分析碳、氮穩定同位素。碳氮同位素比值分析所用儀器為Carlo Erba NA 2500元素分析儀和Delta Plus同位素質譜儀(中國科學院水生生物研究所), 分析測試結果以δ形式表示, 定義為:δX (‰)=[(Rsample/Rstandard)-1]×1000; 式中, X是13C或15N; Rsample為所測得的同位素比值, 碳同位素是13C/12C, 氮同位素是15N/14N; Rstandard為標準物質的同位素比值, 碳氮穩定同位素測定的標準物質分別為VPDB和N2;δ值用于衡量樣品中重同位素的含量, 越小表示樣品重同位素(13C或15N)含量越低, 越大表示樣品重同位素(13C或15N)含量越高。樣品δ13C和δ15N重復測量的標準誤差均小于0.3‰。

1.5 數據統計分析

為了分析蠟質標本制作過程對植物碳、氮穩定同位素值的影響, 我們分別對Control和Dry,Dry和AS, 用配對的T檢驗來檢測它們之間的差異。分析后續保存對標本同位素值影響, 由于數據之間方差不齊性, 采用Friedman的非參數檢驗來判斷保存時間對樣品的影響。所有的統計工作都是用SPSS(第19版)來完成, 柱狀圖用Excel完成繪制。

2 結果

沉水植物鮮樣中的碳、氮穩定同位素值存在較大的種間差異。金魚藻的δ13C值最低為(-24.38±0.32)‰, 馬來眼子菜的δ13C值為(-19.26±0.35)‰,穗花狐尾藻的δ13C值最高為(-16.76±0.14)‰,δ15N同位素值中最低的是馬來眼子菜(0.409±0.11)‰, 穗花狐尾藻(5.67±0.10)‰, 金魚藻最高達到了(12.48±0.11)‰ (圖1)。

與沉水植物鮮樣穩定同位素值相比較, 標本的壓制過程顯著降低了馬來眼子菜、金魚藻和穗狀狐尾藻的碳穩定同位素值(馬來眼子菜、穗狀狐尾藻,P＜0.05; 金魚藻,P＜0.01, 表1), 氮穩定同位素值只有金魚藻出現了顯著的下降(P＜0.05, 表1)。浸泡過程對3種沉水植物樣本的碳、氮穩定同位素均沒有顯著影響。在6個月的短暫保存實驗中, 所有樣本的碳穩定同位素都出現了顯著變化(馬來眼子菜P=0.011, 金魚藻P=0.010, 穗狀狐尾藻P=0.031;圖1、表2)。結果表明, 標本的壓制過程比浸泡過程對碳、氮同位素值產生的影響更大。沉水植物標本的碳穩定同位素值易受標本制作和保存過程的影響, 而氮穩定同位素值卻幾乎不受影響(圖1)。

通過對樣品的碳、氮穩定同位素值差異分析,我們發現不同種類沉水植物δ13C受標本制作和保存階段的影響不同。在壓制過程中馬來眼子菜的δ13C降低了1.78‰, 金魚藻和穗花狐尾藻的δ13C受影響較小, 分別只降低了0.72‰和0.98‰。在浸泡過程中所有植物的δ13C出現一定程度的上升, 穗花狐尾藻的δ13C上升了1‰。保存階段的植物δ13C則出現了不規律的波動, 總體上為先上升后下降的趨勢。植物的δ15N也受標本制作和保存階段的影響,但相對于δ13C來說影響較小, 差異最大的金魚藻δ15N降低了1.13‰。浸泡階段的沉水植物δ15N也呈現上升的趨勢。保存階段的沉水植物δ15N除馬來眼子菜在開始的一個月內上升外, 一直保持較穩定的狀態(表2)。

不同沉水植物個體間δ13C和δ15N存在較大差異, 其中δ13C從-2.95‰變化到1.41‰, 氮的同位素值從-1.76‰變化到1.42‰。所有沉水植物個體δ13C和δ15N的差異整體呈正態分布,δ13C平均值為-0.37‰,δ15N的平均值為-0.18‰(圖2)。

圖1 三種沉水植物在制作和保存過程中的碳、氮穩定同位素值(橫坐標Control代表鮮樣即對照, Dry代表植物干燥后的樣品,AS代表浸泡過后的標本, 1W、1M、2M、3M、4M、5M和6M分別代表保存1周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月和6個月后的標本)Fig. 1 Effects of press procedure, soak procedure and preservation on three submerged macrophytes δ13C and δ15N values (horizontal axis: Control represents fresh samples, Dry represents dry samples, AS represents soaked samples, 1W, 1M,2M, 3M, 4M, 5M and 6M represent samples during preservation period as 1 week, 1 month, 2 month, 3 month, 4 month, 5 month and 6 month)

表1 植物標本在壓制, 浸泡和保存階段碳、氮穩定同位素差異的顯著性情況(“＊”代表0.01＜P＜0.05, “＊＊”代表P＜0.01)Tab. 1 Values of press procedure, soak procedure and preservation of submerged macrophytes analyzed by analysis of variance (ANOVA)(“*” represent 0.01＜P＜0.05，“**” represent P＜0.01)

3 討論

植物組織中的碳、氮穩定同位素值易受外界影響而發生改變, 實驗中我們發現沉水植物標本的碳穩定同位素值在制作和保存過程的影響下變化較大。沉水植物標本的δ13C在壓制過程中出現顯著的下降, 有一種可能是由于不同的植物體內含有的有機化合物的成分不一樣, 在制作和保存標本的過程中, 會與周圍的介質發生同位素中重原子和輕原子的交換, 如13C和12C,15N和14N的交換[31—33]。報紙的主要成分是紙漿和墨水[34], 其中碳元素為主要組成成分之一。在壓制標本的過程中, 植物體內的有機化合物可能與報紙之間發生了成分交換。或者,在壓制的過程中報紙上未完全固定的墨粉壓印到植株表面。最終導致植株的δ13C下降。在浸泡的過程中, 植物標本主要是穗花狐尾藻和馬來眼子菜的δ13C分別上升了1‰和1.78‰。這有可能是由于干燥的植物標本被浸泡在飽和的氯化汞溶液中的過程中, 植物體內的部分有機化合物如葉綠素[35]被溶解進溶液中。從而導致植物碳穩定同位素值的上升。這也同樣可以解釋, 為什么植物的碳同位素比氮穩定同位素受的影響更大, 可溶解的有機物都是含碳的, 但是不一定含有氮元素。

用傳統方法制作的植物標本, 確實會導致某些植物產生穩定同位素的改變。本實驗中所有的沉水植物δ13C都受傳統壓制過程的影響而下降, 其中馬來眼子菜的δ13C下降的幅度最大達到了1.78‰,只有金魚藻的δ15N在壓制過程中出現1.1‰的顯著下降。浸泡后的沉水植物標本中只有穗花狐尾藻和馬來眼子菜的δ13C分別出現了1.00‰和0.52‰的上升, 金魚藻的δ13C增長小于0.08‰。浸泡處理使馬來眼子菜中平均δ15N上升了近一倍, 從0.27‰到0.60‰, 但是仍然沒有顯著性差異, 這可能是由于其較大的組內差異導致的。因此, 我們不能得出一個統一的校正因子, 這是由于不同物種穩定同位素對不同的處理階段的響應存在種間差異導致的。短暫的保存實驗, 不足以讓植物標本中的穩定同位素固定下來。與δ15N不同, 保存階段所有植物的δ13C都出現不同程度上的波動, 不同時間的δ13C存在顯著差異。先前有研究表明, 動物標本的保存過程中其碳、氮穩定同位素值不會隨時間變化[32,36], 但是也有研究表明, 在保存24個月后, 碳穩定同位素會隨著時間而變化[33]。對于動物標本, 由于其生物個體的復雜性, 研究結果尚且不一致。對于水生植物來說仍需要對更長時間的單個物種標本保存來研究其影響。

表2 在壓制、浸泡和保存標本過程中沉水植物碳、氮穩定同位素的變異值(所有值均是與第一次采集的鮮樣做差值?！唉ぁ贝聿钪?Tab. 2 The mean values of submerged macrophytes δ13C and δ15N on press procedure, soak procedure and preservation (Values represent mean difference from control values. “Δ” represents difference)

圖2 標本壓制、浸泡和保存過程中碳、氮穩定同位素值之間的差異Fig. 2 Mean difference of submerged macrophytes δ13C and δ15N values on press procedure, soak procedure and preservation

生態系統中不同對象碳穩定同位素的差異大于3‰。例如, C4和C3植物的穩定碳同位素差異差不多有14‰[37], 在同種環境下,的穩定碳同位素比CO2大7‰[38]。 Angradi等[39]發現藻類的平均碳穩定同位素值為-33‰, 然而陸生植物的碳穩定同位素值接近-23‰。在我們的研究中, 發現植物穩定同位素種間的差異大于3‰。在不同環境下生長的水生植物, 其碳、氮穩定同位素的差異基本都大于3‰[40]。Li等[23]發現不同湖泊生長的苦草的δ13C變化范圍從-27.9‰到-17.9‰, 在不同的湖泊中差異大于3‰。在本實驗中水生植物標本的δ13C受制作和保存的影響較大, 用δ13C作為分析環境變化的工具可能會得到與歷史事實不符的結論。然而,水生植物標本的δ15N只有金魚藻在壓制過程出現δ15N值的顯著下降, 保存階段的δ15N值沒有出現顯著的變化。因此, 我們認為δ15N可以用于對傳統方法制作的水生植物標本的分析。當所研究植物標本的碳、氮穩定同位素的差異大于3‰時, 可以忽略制作和保存過程的影響, 得到的結論的可信度更高。對于歷史的、長期的穩定同位素的變化[41,42],需要開展更長時間的校準實驗, 而且分析的樣品量要足夠大, 這樣才能盡可能地減少錯誤結論。