低溫和5—氮胞苷對油菜花芽分化和DNA甲基化的影響

宋崢 喻艷 汪瑞清

摘要：

以中油雜11號（Brassica napus L.）為材料，采用不同時間低溫處理油菜幼苗，不同濃度5-氮胞苷（5-azaC）藥液處理油菜萌動種子，通過觀察莖尖花芽分化進程并測定莖尖DNA甲基化水平，研究了低溫和5-azaC對油菜花芽分化和莖尖DNA甲基化的影響。結果表明，6℃低溫處理幼苗6、12、18d能促進油菜花芽分化;50μmol/L 5-azaC處理萌動種子促進油菜花芽分化，且與低溫促進花芽分化的作用具有加成作用;250、500μmol/L[JP] 5-azaC處理萌動種子抑制油菜花芽分化;低溫和5-azaC處理均能降低莖尖DNA甲基化水平。說明低溫降低油菜植株莖尖DNA甲基化水平并促進花芽分化;低濃度5-azaC具有代替低溫促進油菜花芽分化的作用;甘藍型油菜為種子春化植物;幼苗比萌動種子更容易受到低溫處理的影響。

關鍵詞：

油菜;5-氮胞苷;低溫;花芽分化;DNA甲基化

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：1019754/jnyyjs20190315011

油菜生長發育過程中需要經歷低溫春化才能從營養生長轉變到生殖生長階段[1]，花芽分化是生長轉變完成的標志。近年來，植物生長轉變研究的熱點之一是轉變過程中DNA甲基化水平的變化及其影響因素[2-5]。5-氮胞苷（5-azaC）是一種去甲基化試劑，在DNA復制過程中能取代胞嘧啶核苷加入到DNA新鏈中，由于嘧啶環上甲基結合部位被氮原子占據，導致DNA鏈不能被甲基修飾而去甲基化。對模式植物擬南芥開花研究的結果表明，低溫、5-azaC和赤霉素都可促進其開花[6]。油菜生長發育與DNA甲基化的研究還很少。本文研究5-azaC和低溫對油菜花芽分化和莖尖DNA甲基化的影響，以期能為油菜生長轉變機理研究提供理論依據。

1材料與方法

11材料

采用甘藍型油菜（Brassica napus L.）中油雜11號為試驗材料（中國農科院油料作物研究所選育并提供）。5-azaC購自Sigma公司。試驗于2007[CD1]2008年度在華中農業大學試驗田進行。

12幼苗低溫處理

10月17日大田直播。11月13日將幼苗移栽于4個苗盆（40cm×30cm×25cm）置于室內，其中3盆分別于0（當日）、6、12d后置于6℃光照培養箱，室內光照條件與培養箱中相同。18d后將全部幼苗移栽回大田，即低溫處理時間分別為18、12、6、0d（CK），記為T3、T2、T1、CK1。每處理種植1小區，順序排列，小區面積14m2，密度11000株/667m2。

處理結束當日每處理取10株幼苗莖尖于-80℃冰箱保存，用于測定DNA甲基化水平。DAT（移栽后天數，days after transplanted）12開始，每4d每小區取7株莖尖，解剖鏡下觀察花芽分化。

13萌動種子5-azaC處理

10月21日將種子均等置于室內4個鋪有濾紙的發芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后將萌發種子置于20℃光照培養箱中，每2d添加1次5-azaC藥液，濃度分別為0（CK）、50、250、500μmol/L，記為CK2、C1、C2、C3。10d后用清水替代5-azaC藥液。15d后將子葉期幼苗移栽入大田。每處理種植1小區，順序排列，小區面積及移栽密度同12。

處理結束當日每處理取10株子葉期幼苗莖尖于-80℃冰箱中保存，用于測定DNA甲基化水平。DAT35開始每4d每小區取7株莖尖，解剖鏡下觀察花芽分化。[JP]

14萌動種子5-azaC加低溫處理

10月21日將種子均等置于室內4個鋪有濾紙的發芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后將萌發種子置于6℃光照培養箱中，每2d添加1次5-azaC藥液，濃度分別為0（CK）、50、250、500μmol/L，記為CK3、C4、C5、C6。10d后將發芽盒轉移至20℃光照培養箱，用清水替代5-azaC藥液。15d后將子葉期幼苗移栽入大田。每處理種植1小區，順序排列，小區面積及移栽密度同12。

取樣方法同13。

15花芽分化進程

通過解剖鏡觀察并參照劉后利[7]油菜花芽分化的分級標準確定花芽分化級別。采用公式1計算花芽分化指數以確定花芽分化進程。

花芽分化指數=∑cfn公式1

注：c-分化級別（1級：生長點膨大，無花原基;2級：具1-5個花原基;3級：花原基進一步增多;4級：花原基伸長;5級：花萼原基分化）;f-每級別分化株數;n-觀察總株數

16莖尖DNA甲基化水平測定

DNA提取：參照李合生[8]CTAB法提取莖尖DNA。

DNA濃度和純度檢測：采用紫外分光光度法比色檢測DNA的濃度和純度。

DNA水解：參照吳筱丹[9]的方法水解DNA。

DNA甲基化水平測定：參照吳筱丹[9]高效液相色譜法（HPLC）測定DNA甲基化水平，并作部分修改。色譜柱：Varian C18柱;流動相：甲醇-5mmol/L庚烷磺酸鈉-三乙胺（10∶90∶02，v/v），pH=40，流速為07ml/min;檢測器波長：273nm。

2結果與分析

21低溫處理幼苗對油菜花芽分化的影響

DAT12所有處理花芽分化指數均為100，花芽分化未開始（圖1）。DAT16 T3花芽分化開始。DAT20 T2花芽分化開始。DAT24所有處理都已經開始花芽分化，此時花芽分化指數T3>T2>T1>CK1。DAT28各處理花芽分化指數比較結果同DAT24。

各處理中T3分化進程最快，其次是T2、T1，CK1分化進程最慢。說明本試驗范圍內，低溫處理油菜幼苗能促進莖尖花芽分化，且低溫處理時間越長，促進效果越好。

22 5-azaC處理萌動種子對油菜花芽分化的影響

DAT35所有處理花芽分化均未開始（圖2）。DAT39 C1花芽分化開始。DAT43所有處理都已經開始花芽分化，此時花芽分化指數C1>CK2>C2>C3。DAT47、DAT51各處理花芽分化指數比較結果同DAT43。

各處理中C1分化進程最快，其次是CK2、C2，C3分化進程最慢。說明本試驗范圍內，低濃度5-azaC處理油菜萌動種子能促進莖尖花芽分化，而中高濃度5-azaC處理則抑制了莖尖花芽分化，且濃度越高，抑制效果越明顯。

23 5-azaC加低溫處理萌動種子對油菜花芽分化的影響

DAT35所有處理花芽分化均未開始（圖3）。DAT39所有處理都已經開始花芽分化，此時花芽分化指數C4>CK3>C5>C6。DAT43、DAT47各處理花芽分化指數比較結果同DAT39。

各處理中C4分化進程最快，其次是CK3、C5，C6分化進程最慢。說明本試驗范圍內，低濃度5-azaC加低溫處理油菜萌動種子能促進莖尖花芽分化，而中高濃度5-azaC加低溫處理則抑制了莖尖花芽分化，且濃度越高，抑制效果越明顯。

對比DAT39～DAT51期間C1和C4處理結果，C4處理花芽分化指數均高于同一時期C1處理。說明本試驗范圍內，低濃度5-azaC與低溫處理對促進莖尖花芽分化有加成作用。

對比39～51 DAT期間CK2和CK3處理結果，CK3處理花芽分化指數均高于同一時期CK2處理。說明本試驗范圍內，低溫處理油菜萌動種子也能促進莖尖花芽分化。

24低溫處理幼苗對莖尖DNA甲基化的影響

油菜幼苗經不同時間低溫處理后，莖尖DNA甲基化水平均低于未處理的對照（表1），T1、T2、T3較對照分別下降了1868%、2173%和2668%。各處理與對照差異顯著，其中T3與對照差異極顯著。說明本試驗范圍內，低溫處理油菜幼苗能降低莖尖DNA甲基化水平，且處理時間越長，下降幅度越大。

25 5-azaC處理萌動種子對莖尖DNA甲基化的影響

DNA甲基化水平均低于未處理的對照（表1），C1、C2、C3較對照分別下降了3094%、2818%和2405%。C1、C2與對照差異顯著，C3與對照差異不顯著。說明本試驗范圍內，5-azaC處理油菜萌動種子能降低莖尖DNA甲基化水平，低濃度處理下降幅度大于中高濃度處理。

[BT（2+1]265-azaC加低溫處理萌動種子對莖尖DNA甲基化的影響[BT）]

油菜萌動種子經不同濃度5-azaC加低溫處理后，莖尖DNA甲基化水平均低于未處理的對照（表1），C4、C5、C6較對照分別下降了4038%、3492%和3129%。各處理與對照差異顯著。處理之間差異不顯著。說明本試驗范圍內，5-azaC加低溫處理油菜萌動種子能降低莖尖DNA甲基化水平，低濃度處理下降幅度大于中高濃度處理。

對比C1～C6同濃度處理結果，莖尖DNA甲基化水平C4

對比CK2和CK3處理結果，莖尖DNA甲基化水平CK3

對比T1和CK3處理結果，油菜幼苗經過6d低溫處理后莖尖DNA甲基化水平為3425%，萌動種子經過10d低溫處理后甲基化水平為3773%。說明油菜幼苗比萌動種子更容易受到低溫處理的影響。

3小結與討論

31低溫降低DNA甲基化水平

本試驗表明低溫處理萌動種子或莖尖降低油菜植株莖尖DNA甲基化水平并促進花芽分化，與李梅蘭等[10]在白菜上研究結果相同。低溫降低DNA甲基化水平致使花芽分化控制基因去甲基化后得到表達，促進花芽分化，或者通過提高植株內源赤霉素含量誘導植株提前抽薹，花芽分化提前[11]，也可能低溫與赤霉素對花芽分化調控是兩條獨立途徑[12]。

32花芽分化與DNA甲基化水平

本試驗表明低濃度5-azaC能代替低溫促進油菜花芽分化，且與低溫處理有加成作用。與李梅蘭等[6]、汪炳良等[13]在白菜、蘿卜上研究結果相同。5-azaC降低植株DNA甲基化水平進而促進花芽分化，與低溫處理的加成作用可能正是因為兩者具有相同的作用途徑。甲基化水平下降可以促進花芽分化，但也會對植株產生其它影響，中高濃度5-azaC對植株產生了一定的毒害作用，造成植株體內代謝紊亂，從而抑制了花芽分化。

33甘藍型油菜春化類型

本試驗表明6℃低溫處理中油雜11號萌動種子10d后植株花芽分化進程較未經低溫處理的植株提前，說明萌動種子也能接受低溫誘導從而導致植株提前花芽分化，證明甘藍型油菜為種子春化植物，與冬小麥、蘿卜、白菜等[14]相同，與綠體春花植物甘藍[14]不同。

34低溫處理與植株大小

本試驗表明油菜幼苗經過6℃低溫處理6d后DNA甲基化水平相比萌動種子經過6℃低溫處理10d后更低。說明油菜幼苗比萌動種子更容易受到低溫處理的影響。植株幼苗各種生理代謝活動比萌動種子活躍，接受外界刺激的應激反應也更強烈，因而更容易受低溫處理影響。

參考文獻

[1]

丁秀綺.白菜型春油菜花芽分化研究[J].作物學報，1990，16（1）：83-90.

[2] Finnegan E J， Peacock W J， Dennis E. DNA methylation， a key regulation of plant development and other processes[J]. Cur Opion in Genet and Develop， 2000（10）： 217-223.