羥基酪醇抑菌活性及抑菌穩定性研究

羅思源，楊秋瑜，李 敏，譚程月，蔣雪蓮，賈利平，杜彥霖，丁春邦

四川農業大學生命科學學院，雅安，625014

羥基酪醇(hydroxytyrosol)，化學名為3，4-二羥基苯乙醇，化學式為C8H10O3，屬于酚類化合物，廣泛存在于橄欖科橄欖屬植物的枝葉和果實中。在油橄欖葉和橄欖油中，少量的羥基酪醇以游離形式存在，而大部分與葡萄糖和橄欖酸相結合而形成橄欖苦苷。在酸性或者堿性環境下，橄欖苦苷易降解產生羥基酪醇[1]。羥基酪醇具有多種生物活性，Wani等[2]發現羥基酪醇可以顯著地清除體外自由基，并且能夠保護細胞，具有預防心腦血管疾病的作用[3,4]。羥基酪醇結合形成的橄欖苦苷被證實具有一定的抑菌活性，吳遵秋等人發現橄欖苦苷對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.025 mg/mL[5]。也有研究指出多酚類化合物也表現出較強的抑菌活性，從香菜、茶樹花和女貞等植物中提取出的多酚類化合物均表現出顯著的抑菌作用[6-8]。劉靜等人發現紫甘藍多酚對醋酸菌的抑菌作用較強，而對大腸桿菌的抑制作用較弱[9]。但關于羥基酪醇抑菌的報道較少。

因此，本研究采用試管半倍稀釋法來測定羥基酪醇對大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)共四種供試菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，探究了羥基酪醇對四種供試菌生長情況和細胞膜完整性的影響，并探討了其在鹽和蔗糖兩種介質中抑菌活性的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥基酪醇購于陜西米爾康生物科技有限公司，純度為70%。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為四川農業大學植物學實驗室保存。

牛血清白蛋白和考馬斯亮藍G-250(北京博奧拓達科技有限公司)；蛋白胨和酵母提取物(英國OXOID 公司)；瓊脂粉、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉等(成都市科龍化工試劑廠)，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BT-124S型電子天平(德國Sartorius公司)，RM-220實驗室超純水機(四川沃特爾科技發展有限公司)，YYQ-SG41-280高壓蒸汽滅菌鍋(上海華線醫用核子儀器有限公司)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海齊欣科學儀器有限公司)，Spectra Max M2酶標儀(美國Molecular Devices公司)，DNP-9082電熱恒溫培養箱(上海三發科學儀器有限公司)，THZ-100恒溫培養床(上海一恒科學儀器有限公司)，高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定

采用試管半倍稀釋法[10]測定羥基酪醇的MIC。羥基酪醇溶解于LB液體培養基，配制為10 mg/mL的母液。根據試管半倍稀釋法稀釋成相應濃度，向每管中加入50 μL菌濃度為106CFU/mL的菌懸液，另取兩個試管分別作為陰性對照和空白對照。放于37 ℃恒溫搖床上，震蕩(180 rpm)24 h，對比陰性對照和空白對照管，觀察渾濁程度，第一個不出現渾濁現象的試管所對應的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。從所有不渾濁的試管中吸取100 μL液體均勻涂布于LB固體培養基上，37 ℃培養箱中繼續培養24 h，菌落數小于5個的平板所對應的濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.2 生長曲線測定

根據Liu等[11]的方法測定四種供試菌的生長曲線。將四種供試菌調整濃度為2.5×106CFU/mL，分別取1.6 mL菌液于試管中，加入用LB液體溶解的羥基酪醇，使其終濃度為0、0.5、1倍MIC。置于37 ℃恒溫搖床中，200 rpm震蕩培養，每間隔1 h吸取菌液于600 nm處測定吸光值，連續測定12 h。以吸光值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制四種供試菌的生長曲線。

1.3.3 細胞膜完整性檢測

1.3.3.1 核酸泄漏測定

根據Lv等[12]方法測定核酸泄露情況。四種供試菌用0.1 M PBS(pH=7.4)清洗2遍后調整濃度為2×108CFU/mL，取菌液0.5 mL于試管中，加入用PBS(pH=7.4)溶解的羥基酪醇，使其終濃度為0、0.5、1 MIC。放于37 ℃恒溫搖床上，250 rpm震蕩4 h，12 000 rpm離心5 min，取上清液在260 nm處測定吸光值。

1.3.3.2 可溶性蛋白泄漏測定

標準曲線制作：配置牛血清蛋白標準溶液，按照Liu等[13]方法配置考馬斯亮藍G-250顯色液，取無菌試管，加入0.1 mL 標準蛋白溶液和0.5 mL 顯色液，震蕩混勻后加入1 mL蒸餾水，混勻，靜置2 min，595 nm處測定吸光值，以蛋白質含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

樣品可溶性蛋白測定[14]：取離心后的上清液0.1 mL，加入0.5 mL顯色液，震蕩混勻后加入1 mL蒸餾水，混勻，靜置2 min，595 nm處測定吸光值，根據標準曲線計算可溶性蛋白含量。

1.3.4 抑菌穩定性測定

1.3.4.1 鹽濃度對抑菌穩定性的影響

羥基酪醇用LB液體培養基溶解，并加入不同濃度的NaCl，取1.6 mL樣液和1.6 mL菌液，使菌終濃度為1×106CFU/mL，羥基酪醇的終濃度為0.5 MIC和1 MIC，NaCl的終濃度為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，放于恒溫搖床(37 ℃)中200 rpm震蕩12 h，每隔1 h在無菌環境中吸取樣液在600 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標，時間為橫坐標繪制曲線圖。

1.3.4.2 蔗糖濃度對抑菌穩定性的影響

用LB液體培養基溶解羥基酪醇，并加入不同濃度的蔗糖(C12H22O11)，取1.6 mL樣液和1.6 mL菌液，使菌終濃度為1×106CFU/mL，羥基酪醇的終濃度為0.5 MIC和1 MIC，C12H22O11的終濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%，放于恒溫搖床(37 ℃)中200 rpm震蕩12 h，每隔1 h在無菌環境中吸取樣液在600 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標，時間為橫坐標繪制曲線圖。

1.4 數據處理

采用GraphPad prism 6.0 對數據進行統計分析并制圖，所有實驗均重復三次，結果以平均值±標準誤差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

從表1中可以看出，羥基酪醇對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好， MIC均為0.625 mg/mL，MBC均為1.250 mg/mL；對銅綠假單胞桿菌的抑制效果次之，MIC為1.250 mg/mL，MBC為2.500 mg/mL；而對枯草芽孢桿菌的抑制效果相對較弱，MIC為2.500 mg/mL，MBC為5.000 mg/mL。

羥基酪醇屬于多酚類化合物，多酚化合物具有較強的抑菌活性。李應洪等[15]發現樟樹葉多酚對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC相同，為1.250 mg/mL，王明華等[16,17]也發現玉米須多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑制作用，申凱等[18]發現菱莖多酚對大腸桿菌的MIC為6.250 mg/mL。相比之下，本研究中羥基酪醇對四種供試菌的MIC小于其他的研究結果。因此本研究結果表明，羥基酪醇的抑菌活性強于總多酚的抑菌活性。

表1 羥基酪醇對四種供試菌的MIC和MBC測定結果

注：“+”表示長菌，“-”表示無菌生長。

Note:“+” means bacteria grows,“-” means no bacteria grows.

2.2 羥基酪醇對細菌生長曲線的影響

從圖1中可以看出羥基酪醇對四種供試菌的生長均有一定的抑制效果，且隨著濃度的增大抑制效果越明顯。在12 h內，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌快速繁殖，成對數生長。加入1 MIC的羥基酪醇很明顯抑制了細菌的生長，而低濃度的羥基酪醇對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長無顯著抑制作用，對銅綠假單胞桿菌的生長有一定的抑制作用。枯草芽孢桿菌在7小時后開始成對數生長，而0.5 MIC和1 MIC的羥基酪醇均在對數期抑制該菌的生長。結果表明羥基酪醇抑制細菌生長主要是在對數生長期起抑制作用。

圖1 羥基酪醇對四種菌生長狀況的影響Fig.1 The effect of hydroxytyrosol on the four test-supplied strains’ growth 注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis

2.3 羥基酪醇對細菌細胞膜完整性的影響

細胞膜作為防止胞外物質進入細胞的一個重要屏障，保障了細胞內相對穩定的狀態，且能選擇和調節物質進出細胞，維持整個細胞內各個生理反應的正常進行。當細胞膜的通透性發生改變時，細胞內的一些對細胞生存必不可少的內容物如核酸、蛋白質等發生泄露，細胞的生存能力逐漸減弱，進而導致細胞的死亡[14]。

從圖2中可以看到，與對照組相比，低濃度的羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的核酸泄露無顯著影響(P> 0.05)，而高濃度卻顯著提高這三種菌核酸泄漏量(P< 0.001)。由圖1也可以看出低濃度的羥基酪醇對這三種菌的生長抑制并不明顯，而高濃度卻顯著抑制菌的生長。在低濃度下，羥基酪醇就能夠顯著提高枯草芽孢桿菌的核酸泄漏量(P< 0.05)，這與圖1中低濃度的羥基酪醇就能顯著抑制枯草芽孢桿菌的生長相符合。

從圖3可以看出高濃度的羥基酪醇明顯的促進四種供試菌可溶性蛋白的泄漏，在低濃度下僅枯草芽孢桿菌的可溶性蛋白泄漏與對照組有顯著差異(P< 0.05)。從圖2可以看出，低濃度的羥基酪醇僅顯著導致枯草芽孢桿菌體內核酸的泄露，因此，圖3的結果與圖2的結果相符合。菌體內可溶性蛋白和核酸的大量泄露往往是由于細胞屏障—細胞膜受損而導致的。黃詩琪等[19]發現經客家黃酒多酚處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜完整性被破壞，體內蛋白質泄露顯著。錢麗紅等[20]也發現茶多酚會破壞金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的細胞膜完整性，導致胞內內容物大量泄露。從圖2和圖3可以看出經羥基酪醇處理后，細菌體內的核酸和可溶性蛋白質大量外泄，表明羥基酪醇主要是通過破壞細菌細胞膜的完整性來抑制細菌生長。

2.4 鹽濃度對抑菌穩定性的影響

在食品添加劑中常常加入一定濃度的鹽，高濃度的鹽引起高滲透壓，抑制細菌的生長。大腸桿菌在0～3.0%的NaCl濃度中可以正常生長，在0～5.0% NaCl濃度下枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌能夠正常生長，對于大多數微生物而言，0～2.0% NaCl濃度是其最適宜生長的環境[21]。因此，本實驗探究在0.5%～2.0%的NaCl濃度下，羥基酪醇對四種供試菌的抑制作用是否有影響。

從圖4可以看出，在含有1.0% NaCl的培養基中，低、高濃度的羥基酪醇對大腸桿菌的抑菌活性穩定(圖4 A、圖4 B)；低濃度的羥基酪醇在2.0% NaCl濃度下對金黃色葡萄球菌的抑菌活性穩定(圖4 C)，但在1.0% NaCl介質中，經高濃度羥基酪醇處理后，細菌的生長和對照組無差異(圖4 D)，因此抑菌穩定性被破壞。由圖4 E、圖4 F可以看出，在2.0% NaCl介質下，經低濃度和高濃度的羥基酪醇處理后，細菌的生長與對照相比更弱，因此在此鹽濃度下，低、高濃度的羥基酪醇對銅綠假單胞桿菌的抑菌活性穩定；而在不同濃度的NaCl下，低、高濃度的羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均未受到改變，仍對枯草芽孢桿菌的生長有顯著抑制作用。因此在NaCl介質中，羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均穩定。

圖2 四種供試菌核酸泄露情況Fig.2 The effect of hydroxytyrosol on the four test-supplied strains’ growth注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌；*表示P <0.05;***表示P <0.001。Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis.“*” means P < 0.05;“***” means P < 0.001.

圖3 四種供試菌可溶性蛋白泄露情況Fig.3 The soluble protein leakage of the four test-supplied strains’ growth注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌；*表示P <0.05;***表示P <0.001。Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis.“*” means P < 0.05;“***” means P < 0.001.

圖4 不同NaCl濃度下四種供試菌的生長情況Fig.4 The effect of different concentration NaCl on the four test-supplied strains’ growth.注：大腸桿菌(A)0.5 MIC;(B)1 MIC；金黃色葡萄球菌(C)0.5 MIC;(D)1 MIC；銅綠假單胞桿菌(E)0.5 MIC;(F)1 MIC；枯草芽孢桿菌(G)0.5 MIC;(H)1 MIC。Note:E.coli (A) 0.5 MIC;(B) 1 MIC；S.aureus (C) 0.5 MIC;(D) 1 MIC; P.aeruginosa (E) 0.5 MIC;(F) 1 MIC;B.subtilis (G) 0.5 MIC;(H) 1 MIC.

2.5 蔗糖濃度對抑菌穩定性的影響

在食品中常常加入一定濃度的糖來調節風味，在一定程度上，這類糖成了細菌生長的碳源。在食品中常常加入一些抑菌物質來實現防腐效果，而抑菌物質的抑菌效果又受到介質如pH、鹽和糖等的影響[22]，因此為了探究蔗糖介質對羥基酪醇抑菌穩定性影響，本實驗將羥基酪醇處于不同濃度的蔗糖介質下，通過供試菌的生長曲線來探究其抑菌穩定性。

從圖5可以看出在低、高濃度羥基酪醇下，加入不同濃度的C12H22O11，實驗組中細菌的生長均超過對照組，所以羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌活性遭到破壞。加入不同濃度的C12H22O11會減弱羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑制效果。加入低濃度的C12H22O11，高濃度的羥基酪醇仍然對枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用；但加入高濃度的C12H22O11(0.20%)會破壞羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌效果。

高濃度的糖會抑制細菌生長，而本實驗中，采用的蔗糖濃度為0.05%～0.20%之間，相對而言屬于低濃度，不會對細菌的生長有抑制作用。在此濃度下實驗結果表明羥基酪醇的抑菌穩定性被破壞，可能是由于羥基酪醇破壞了細胞膜的結構，而及時補充碳源，讓細菌快速合成所被破壞掉的成分，這樣就破壞了羥基酪醇的抑菌能力。因此羥基酪醇不適合用于作為低糖濃度下的防腐劑。相關原因需要進一步研究探討。

3 結論

大多數多酚類化合物具有抑菌活性，茶多酚[20]、黃酒多酚[19]、玉米須多酚[17]等。在抑菌活性研究中，多以多酚提取物為主要研究對象進行研究，而少有文獻對組成多酚的單體進行單獨抑菌活性研究。李應洪等[15]發現樟樹葉多酚對大腸桿菌的MIC為1.250 mg/mL，而本研究中羥基酪醇對大腸桿菌的MIC為0.625 mg/mL；申凱等[18]發現菱莖多酚對金黃色葡萄球菌的MIC為6.250 mg/mL，而羥基酪醇對金黃色葡萄球菌的MIC為0.625 mg/mL；張添菊等人[23]發現藍莓葉多酚對枯草芽孢桿菌的MIC為9.300 mg/mL，而羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的MIC為2.500 mg/mL。因此可以得出羥基酪醇的抑菌活性比多酚提取物的抑菌活性較強，可以作為一種新型的防腐劑。

圖5 不同C12H22O11濃度下四種供試菌的生長情況Fig.5 The effect of different concentration C12H22O11 on the four test-supplied strains’ growth注：大腸桿菌(A)0.5 MIC;(B)1 MIC；金黃色葡萄球菌(C)0.5 MIC;(D)1 MIC；銅綠假單胞桿菌(E)0.5 MIC;(F)1 MIC；枯草芽孢桿菌(G)0.5 MIC;(H)1 MIC。Note:E.coli (A) 0.5 MIC;(B)1 MIC；S.aureus (C) 0.5 MIC;(D) 1 MIC;P.aeruginosa(E) 0.5 MIC;(F) 1 MIC;B.subtilis (G) 0.5 MIC;(H) 1 MIC.

本實驗結果表明，羥基酪醇具有較強的抑菌效果，對四種供試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為0.625、0.625、1.250、2.500 mg/mL，MBC分別為1.250、1.250、2.500、5.000 mg/mL。羥基酪醇主要在細菌對數生長期抑制其生長。經羥基酪醇處理后，菌體泄漏大量核酸和可溶性蛋白，初步推測羥基酪醇抑菌的機理可能是破壞細菌細胞膜的完整性。羥基酪醇在1.0% NaCl介質中抑制大腸桿菌的抑菌活性穩定；低濃度的羥基酪醇在2.0% NaCl下對金黃色葡萄球菌的抑菌活性穩定，高濃度的羥基酪醇在0.5%、1.5%和2.0% NaCl下抑菌活性穩定；2.0% NaCl濃度下，羥基酪醇對銅綠假單胞桿菌抑菌活性穩定；在不同鹽濃度下羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均穩定。而在不同糖溶液中，羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的抑制效果被破壞，對枯草芽孢桿菌的抑制效果減弱，因此羥基酪醇在糖介質中抑菌活性不穩定。