有機溶液環境中的迷迭香酸納濾分離行為及富集工藝

李存玉，馬 赟，李紅陽，彭國平*

1南京中醫藥大學藥學院；2江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，南京 210023

低濃度有機溶液環境中中藥成分的富集多采用減壓或常壓熱濃縮處理，導致熱敏性有效成分解離、轉化而難以獲得。因此，在食品、醫藥行業中迫切需要一種可常溫處理，不破壞成分組成的分離技術以改善低濃度有機溶液環境下熱敏性成分的精制富集[1]。納濾是膜分離技術中的一種，截留分子量在100～1 000 Da，具有分離過程可常溫操作，無熱效應，能耗低等技術優勢[2]，在熱敏性活性成分分離精制等制藥、醫療領域具有獨特優勢[3-6]。

納濾分離原理主要包含道南效應和溶解-擴散效應，其中道南效應又稱電荷效應，納濾膜荷負電性，與離子間形成靜電作用，加上立體阻礙，造成膜對離子的截留率有差異[7]。納濾膜孔與溶質分子的相互作用，也呈現出在位阻效應基礎上的溶解-擴散理論，溶質溶解在膜中，并隨著推動力擴散傳遞，物相之間存在化學平衡[8]。但目前對低濃度有機溶劑處理尚處于初步階段[9]，且分離機制不清晰。

迷迭香酸作為迷迭香中最有效的抗氧化成分之一，已被美國食品藥物管理局認可為“公眾安全食品”，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、免疫抑制等作用[10]。作為一種多酚羥基化合物，分子式C18H16O8(360.31 Da)，對光照、溫度敏感[11]，在精制分離過程中，因低濃度乙醇溶液環境下的減壓加熱濃縮，存在效率低、成分存在轉化的技術難題。基于前期對納濾分離規律的積累，以色譜分離得到的迷迭香酸中間體為對象，探索低濃度乙醇溶液環境中下的納濾分離行為，為其精制分離提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納濾膜(聚酰胺復合膜，截留分子量150、450、800 Da)，南京拓鉒醫藥科技有限公司；迷迭香酸對照品(批號111871-201505，質量分數：98.5%)，中國食品藥品檢定研究院；迷迭香提取物(批號201505，質量分數≥98%)，南京澤朗醫藥科技有限公司；迷迭香酸中間體(迷迭香提取物由色譜分離制備得到)，實驗室自制；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TNZ-1型納濾分離設備，南京拓鉒醫藥科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀(VWD檢測器，Agilent色譜工作站)，美國安捷倫公司；KH-250B型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發儀，南京科爾儀器設備有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的制備

迷迭香酸對照品溶液：精密稱取迷迭香酸對照品0.015 20 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得迷迭香酸對照品溶液(1.52 mg/mL)。

迷迭香酸供試品溶液：取迷迭香酸中間體，根據實驗要求的相應濃度，加入迷迭香酸提取物，分別采用純化水或低濃度乙醇水溶液超聲溶解混勻，即得。

1.3.2 迷迭香酸的測定

色譜條件[12]：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-1.0%磷酸水溶液(40∶60，v/v)；檢測波長：320 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

線性關系：精密吸取迷迭香酸對照品溶液0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mL分別置于10 mL的量瓶中，甲醇定容至刻度，Agilent 1100高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品溶液濃度為橫坐標(X)，得線性回歸方程：Y=12.98X-31.21，R2=0.999 9。采用高效液相色譜法，根據所測得峰面積由公式算出迷迭香酸質量濃度，進而計算相應的截留率。

1.3.3 納濾分離

組裝納濾膜與TNZ-1納濾分離設備，取迷迭香酸供試品溶液置于納濾系統中進行循環平衡，待迷迭香酸在納濾膜中的吸附-解吸附達到平衡時，取樣平衡液，進而將溶液進行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

取系列平衡液和納濾液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液注入高效液相按“1.3.2迷迭香酸的測定”項下的檢測方法和線性回歸方程計算迷迭香酸濃度。

1.3.4 迷迭香酸濃度對截留率的影響

根據實際色譜分離得到的迷迭香酸溶液中間體，在20%乙醇濃度條件下，調節迷迭香酸濃度為0.01、0.05、0.15、0.50、1.00、1.50 mg/mL，采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進行分離，操作壓力1.0 MPa，待納濾完成后，根據平衡液及納濾液中迷迭香酸濃度，分別計算迷迭香酸濃度對其截留率的影響。

1.3.5 乙醇濃度對膜通量影響

在迷迭香酸濃度為0.50 mg/mL條件下，調節乙醇濃度分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進行納濾分離，操作壓力1.0 MPa，待膜通量穩定后，收集膜通量數據。

1.3.6 乙醇濃度對迷迭香酸截留率的影響

在迷迭香酸濃度為0.50 mg/mL條件下，調節乙醇濃度分別為0%、5%、10%、20%、30%、40%的迷迭香酸供試品溶液，采用截留分子量150、450、800 Da的納濾膜進行分離，操作壓力1.0 Mpa，待納濾完成后，根據平衡液及納濾液中迷迭香酸濃度，分析乙醇濃度對迷迭香酸截留率的影響。

1.3.7 截留率和轉移率計算

分別精密吸取納濾(或減壓濃縮)分離過程中產生的原液、平衡液、納濾(或濃縮)液，按上述相關項下的檢測條件，計算待測組分的質量濃度，按式(1)計算截留率，按式(2)計算轉移率。

(1)

(2)

式中，R為截留率；D為轉移率；C0為原液中迷迭香酸濃度；C1為納濾液中迷迭香酸濃度；C2為平衡液中迷迭香酸濃度；C3為減壓濃縮液中迷迭香酸濃度。

1.3.8 響應曲面試驗設計分析因素交互作用

對含有有機試劑的迷迭香酸供試品溶液進行納濾分離，其中乙醇濃度、迷迭香酸濃度、截留分子量對截留率具有一定影響，且三者可能存在一定的交互作用，基于此采用Design-Expert 8.06軟件，選擇乙醇濃度、溶質濃度、截留分子量為考察因素，以-1、0、1代表變量水平，進行Box-Behnken設計三因素三水平實驗方案(見表1)。

表1 納濾濃縮因素與水平

1.3.9 乙醇濃度對迷迭香酸減壓濃縮的影響

采用減壓濃縮與納濾富集進行對比，采用溫度60 ℃、壓力-0.1Mpa，20%乙醇濃度條件下，考察溶液體積從500 mL減壓濃縮至50 mL，分析減壓濃縮對迷迭香酸轉移率的影響。

1.3.10 納濾膜耐用性研究

根據優選出的迷迭香酸納濾分離參數，進行長時間循環分離，待循環溶液量達到5、10、20、50、100 L時，采用純化水清洗，計算膜通量，分析乙醇水溶液條件下的納濾膜耐用性。

2 結果與討論

2.1 迷迭香酸濃度對納濾分離的影響

從圖1中迷迭香酸截留率曲線變化可以看出，在20%乙醇水溶液環境中，隨著溶質濃度和納濾膜截留分子量的升高，迷迭香酸截留率均表現出下降的，此結果符合納濾分離原理中的分子切割和溶解-擴散效應[13,14]，提示低濃度和低截留率分子量有利于提升溶質分子的截留率。針對圖1結果和實際色

圖1 迷迭香酸濃度對截留率的影響Fig.1 Effect of concentration on the rejection of rosmarinic acid

譜制備過程中的迷迭香酸的濃度，對0.15～1.50 mg/mL濃度范圍進行下一步考察。

2.2 乙醇濃度與膜通量的相關性

分析圖2可以得出，隨著乙醇濃度的升高，膜通量呈現出下降趨勢，其中以截留分子量800 Da的納濾膜最為明顯，這主要是因為隨著水溶液中乙醇濃度逐步升高，在0%至40%范圍內，溶液黏度逐步增加，而黏度與溶液擴散系數呈負相關，因此隨著乙醇濃度的升高，溶液在納濾膜表面的溶劑擴散系數下降，從而出現通量下降的結果[15,16]。同時，乙醇對膜材質有一定的溶脹作用，引起膜孔徑縮小，也對膜通量具有一定的影響。

圖2 乙醇濃度對膜通量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the membrane flux

2.3 乙醇濃度對迷迭香酸截留率的影響

從圖3可知，乙醇濃度對截留分子量150 Da的納濾膜分離行為影響不明顯。隨著乙醇濃度升高至40%，迷迭香酸在800 Da的納濾膜中截留率從20.8%升高至95.6%。考慮到乙醇對膜材質溶脹損傷，并結合實際生產，對5%～30%乙醇濃度范圍進行下一步考察。基于膜截留分子量和乙醇濃度比對迷迭香酸截留行為的交互影響，實際制備得到的迷迭香酸濃度的不確定性，選擇響應面法對迷迭香酸的分離行為進行優化研究，為實際生產中納濾濃縮參數的選擇提供依據。

圖3 乙醇濃度對迷迭香酸截留率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the rejection of rosmarinic acid

2.4 響應面法分析優化納濾分離參數

為進一步優化納濾富集迷迭香酸中間體，根據Box-Benhnken中心組合設計原理，選取乙醇濃度、溶質濃度和截留分子量3個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，研究三因素不同組合對迷迭香酸截留率的影響。納濾操作以迷迭香酸在納濾膜中的吸附-解吸附達到平衡后，取樣分析，平行操作3次，截留率取平均值。試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應曲面設計與結果

2.4.1 模型方程建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.06軟件對試驗結果進行回歸擬合，得到迷迭香酸截留率對以上3個因素的二次多項回歸模型：

表3 回歸模型的方差分析結果

迷迭香酸截留率Y-91.73+5.99A-2.94B-8.34C+0.99AB+5.37AC-2.09BC-0.78A2+0.6B2-7.71C2。對該模型進行方差分析，結果見表3。回歸F值為58.55，多元相關系數R2=0.986 9，預測R2=0.826 8，調整R2=0.970 0，說明模型對試驗實際情況擬合較好，試驗誤差小。迷迭香酸納濾分離模型的P<0.0001，表明回歸模型極顯著，可用來進行響應值的預測，試驗設計方案正確。

由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，迷迭香酸納濾分離模型的一次項(A、B、C)、二次項(C)及交互項(AC、BC)均表現出顯著性(P<0.01)或較顯著性(P<0.05)。表明各影響因素對于迷迭香酸截留率的影響并不是簡單的線性關系。

表4 響應曲面二次回歸模型的方差分析

注：**P<0.01顯著；*P<0.05較顯著。

Note:**P<0.01 highly significant;*P<0.05 significant.

2.4.2 響應曲面分析及條件優化

多元回歸方程式所做的響應曲面圖，見圖4。所考察因素對迷迭香酸截留率均有不同程度的影響，其中截留分子量影響顯著，隨著納濾膜孔徑的減小，根據孔徑篩分效應其截留效果呈現上升趨勢。乙醇濃度對迷迭香酸截留率影響顯著，曲面斜率大，隨著乙醇濃度的增加，迷迭香酸截留率升高，根據納濾分離中的溶解-擴散模型，因為隨著乙醇濃度增加，溶液黏度引起的擴散系數減小而導致迷迭香酸難以接近膜表面，而難以透過納濾膜。溶質濃度降低其截留率在一定范圍內表現出升高的現象，主要是因為迷迭香酸擴散系數逐漸減小，其截留率呈現上升趨勢。對于迷迭香酸截留率的影響，考察因素中乙醇濃度與截留分子量交互作用顯著，在迷迭香酸濃度固定的條件下，隨著乙醇濃度升高或截留分子量的降低，截留率呈現上升趨勢。

圖4 各因素交互作用對迷迭香酸得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of factors on the extraction yield of rosmarinic acid

2.5 納濾分離優化及減壓濃縮對比分析

由Design-Expert軟件優化分析，結合迷迭香酸中間體制備時所涉及的乙醇濃度，以及納濾分離效率，優選出的納濾分離參數為：溶質濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.63%，截留分子量450 Da，理論計算迷迭香酸截留率為95.00%。為了驗證回歸模型的有效性，根據擬合的最佳工藝參數和試劑操作的可行性，調整為溶質濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.00%，截留分子量450 Da條件下進行驗證性實驗并與減壓濃縮工藝進行對比，結果見表5。在迷迭香酸保留方面，納濾高于傳統的減壓濃縮，傳統的減壓濃縮由于乙醇含量較低，效率低下。在對比試驗開展過程中發現納濾分離周期遠遠低于減壓濃縮，技術優勢明顯。

表5 濃縮工藝對比

2.6 納濾膜耐用性

隨著納濾膜使用周期的延長，膜通量呈現出衰減的現象，從圖5可以看出，在20%乙醇溶液環境中，當循環體積低于10 L時，通過純化水清洗，可以抑制因有機溶劑浸泡而導致納濾膜材質溶脹，或溶液引起的膜孔堵塞污染，而保持納濾膜通量。當循環藥液體積量增加并長周期使用，純化水清洗效果下降，可能是由膜材質溶質的不可逆性或膜污染的清洗效率降低引起的。此結果提示，在納濾膜在有機溶液環境下使用時，應注意使用周期及清洗方法，方能保障膜通量、降低膜污染。在膜通量逐漸衰減的同時，迷迭香酸截留率并未發生明顯變化，提示納濾膜組件分離性能的耐用性較好。

圖5 循環體積對膜通量衰減和溶質截留率的影響Fig.5 Effect of circulating volume on the membrane flux and rejection

3 結論

基于膜分離技術考察迷迭香酸中間體富集方法，分析在低濃度乙醇溶液環境中迷迭香酸的納濾膜分離傳質行為，低濃度乙醇溶液黏度高于水溶液，引起迷迭香酸擴散系數降低，而不容易進入納濾膜表面而提高截留率。在提高分離效率保障截留率的前提下，優化出的納濾分離參數為溶質濃度0.41 mg/mL，乙醇濃度20.00%，截留分子量450 Da，迷迭香酸實際截留率高于93%，且可以根據溶質濃度及乙醇濃度，通過建立的模型方程進行參數優化，方法具有較強的適用性。

食品、藥品原料的制備因熱處理導致成分分解轉化的技術瓶頸，通過建立模型完成工藝優選[17]，在一定程度上可以通過納濾分離技術予以替換，尤其是含有低濃度乙醇的溶液環境下。迷迭香酸熱穩定性差，通過納濾常溫富集可以提升其濃度數十倍以上，并不造成成分損失，且生產周期較減壓濃縮短，技術優勢明顯。以此方法制備的迷迭香酸進而與冷凍干燥等技術制備的原料，將可以較好的保留其抗氧化活性，降低其在食品、化妝品和藥品中的使用成本。