臨沂地區高毒力肺炎克雷伯菌分型及其耐藥表型檢測的研究*

范厚臻，孫運芳

(1.山東省臨沂市中醫醫院檢驗科 276003;2.山東醫學高等專科學校檢驗系，山東臨沂 276000)

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是引起醫院感染的主要病菌，已成為僅次于大腸埃希菌后第二致病菌，根據致病性不同常分為普通肺炎克雷伯菌(classic klebsiella pneumoniae)與高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent klebsiella pneumoniae)[1]。與普通肺炎克雷伯菌比較，高毒力肺炎克雷伯菌表現為可感染無基礎疾病人群、首要癥狀為原發性肝膿腫、培養菌落為高黏性等特點[2-3]。調查研究發現，高毒力肺炎克雷伯菌多表現為K1、K1莢膜血清型，這兩種莢膜血清型也是社區獲得性感染的關鍵毒力因子[4]。耐藥肺炎克雷伯菌感染是抗感染治療中面臨的最嚴重問題，有學者報道高毒力肺炎克雷伯菌感染超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)菌株檢出率為20.7%～65.2%[5]。自我國臺灣學者報道高毒力肺炎克雷伯菌以來，目前所報道病例多集中于亞洲地區與亞裔居民[6]。高毒力肺炎克雷伯菌感染是否具有地域或體質易感性，目前學者研究較少。本文以此為背景，回顧性分析臨沂地區高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床資料，探討高毒力克雷伯菌分型、耐藥表型與感染的關系。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2015年1月至2017年9月臨沂市中醫醫院住院患者分離肺炎克雷伯菌98株及病歷資料，所有患者均出現肺炎克雷伯菌感染且細菌培養成陽性，排除合并其他病原菌感染者。

1.2主要儀器與試劑 全自動微生物鑒定儀：法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact；聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀：美國Bio-Rad公司PTC-200；電泳儀：美國Bio-Rad公司DYY-6D；凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；PCR試劑與DNA marker Ⅰ：大連TaKaRa生物公司。

1.3檢測方法

1.3.1菌株分離培養 98株肺炎克雷伯菌直接接種于血瓊脂平板上，37℃培養24 h，挑單一菌落進行分純孵育，采用全自動微生物鑒定儀重新鑒定菌株，PCR擴增測序確認。

1.3.2高黏液表型檢測 采用拉絲試驗方法，使用接種環挑取血瓊脂平板上新鮮菌落進行牽拉，重復2次。黏液絲形成且長度大于或等于5 mm則判斷為高黏液表型陽性，黏液絲形成且長度小于5 mm判斷為陰性[7]。

1.3.3藥敏試驗 采用紙片擴散法對9種抗生素進行藥敏試驗，選擇肺炎克雷伯菌ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株，參照美國臨床和實驗室化協會(CLSI)2013年版評估藥敏結果[8]。

1.3.4肺炎克雷伯菌血清型檢測 參照WEI等[9]文獻資料，采用多重PCR檢測K1、K2、K5、K20、K54、K57等6種高毒力血清型基因。

1.3.5肺炎克雷伯菌株毒力基因檢測 參照黎斌斌等[10]文獻資料，采用PCR檢測普通肺炎克雷菌、高毒力肺炎克雷伯菌毒力rmpA基因攜帶情況。

1.3.6高毒力肺炎克雷伯菌菌株確認 參照黎斌斌等[10]文獻資料，將拉絲試驗與rmpA基因均為陽性的黏液型菌株認定為高毒力株。

1.3.7多位點序列分析(MLST) 參照黎斌斌等[10]文獻資料，對管家基因擴增測序分析，根據多位點序列分析數據確定等位基因與ST型。

2 結 果

2.1高毒力肺炎克雷伯菌菌株檢出情況 98株肺炎克雷伯菌中，拉絲試驗檢出高毒力肺炎克雷伯菌33株(33.67%)。

表1 肺炎克雷伯菌感染臨床特征分析

2.2臨床特征 98例肺炎克雷伯菌感染患者中，男74例，女24例；年齡45～78歲，平均(61.33±7.35)歲；感染獲得途徑：醫院獲得性感染57例，社區獲得性感染41例；感染部位：呼吸道74例，腹腔消化道6例，皮膚切口5例，尿液8例，其他5例；預后情況：治愈7例，好轉75例，無效10例，死亡8例。高毒力肺炎克雷伯菌感染與普通肺克雷伯菌感染性別、年齡、感染部位、預后等比較，差異無統計學意義(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌感染社區獲得性感染率(63.64%)明顯高于普通肺炎克雷伯菌感染(30.77%)，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.3分子特征 98例肺炎克雷伯菌感染菌株中，血清型：K1型16株，K2型9株，K5型5株，K20型4株，K57型64株；rmpA基因：陽性41株，陰性57株；MLST分型：ST23型22株，ST15型7株，ST11型5株，ST65型5株，其他59株。高毒力肺炎克雷伯菌K1與K2型占比60.61%(20/33)明顯高于普通肺炎克雷伯菌菌株7.69%(5/65)，差異有統計學意義(χ2=35.000,P<0.01)；rmpA基因陽性率100.00%(33/33)明顯高于普通肺炎伯雷菌菌株(12.31%，8/65)，差異有統計學意義(χ2=37.000,P<0.01)；ST23型51.52%(17/33)明顯高于普通肺炎伯雷菌菌株7.69%，差異有統計學意義(χ2=22.000,P<0.01)。見表2。

表2 肺炎克雷伯菌感染分子特征分析(n)

2.4抗生素敏感性試驗 高毒力肺炎克雷伯菌、普通肺炎克雷伯菌對美羅培南敏感性比較，差異無統計學意義(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌對環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢唑林、氨曲南、哌拉西林、復方磺胺甲噁唑敏感率均明顯高于普通肺炎克雷伯菌，超廣譜β內酰胺酶檢出率低于普通肺炎克雷伯菌(P<0.05)。見表3。

表3 肺炎克雷伯菌對常用抗生素陽性率分析[n(%)]

3 討 論

既往研究高毒力肺炎克雷伯菌主要集中在亞洲或亞裔人群，這是否意味著有地域易感性或體質易感性。臨沂地區高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征與我國其他地區是否存在差異，作者前期研究中并未進行分析[11]。本文研究中98例肺炎克雷伯菌感染血癥患者中，檢出高毒力肺炎克雷伯菌感染33例，普通肺炎克雷伯菌感染65例，兩者在性別、年齡、感染部位等比較無統計學差異，高毒力肺炎克雷伯菌感染社區獲得性感染率明顯高于普通肺炎克雷伯菌。與黎斌斌等[10]報道的北京朝陽醫院、魏丹丹等[12]報道的南昌大學第一附屬醫院基本相似，說明臨沂地區高毒力肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征與我國其他地區并沒有本質上的差異；同時說明高毒力肺炎克雷伯菌感染菌株與社區獲得性肝膿腫明顯相關，而且部分患者并沒有任何基礎疾病。

高毒力肺炎克雷伯菌感染具有高侵襲性、高致死率以及潛在嚴重后遺癥的特點，嚴重威脅人類生命健康[13]。分析高毒力肺炎克雷伯菌株分子特征對于患者診斷治療尤為重要。肺炎克雷伯菌菌體表面莢膜是肺炎克雷伯菌主要毒力因子之一，能夠誘導菌體拮抗宿主免疫殺傷作用[14]。根據莢膜多糖結構與抗原性的差異，目前至少可以分為78個莢膜血清型。相關研究表明，K1、K2、K5、K20、K54、K57等6種血清型與高毒力肺炎克雷菌明顯相關，也是誘導各種侵襲性感染的主要血清型菌株[15-16]。本研究中，K1、K2是高毒性力肺炎克雷伯菌感染的主要血清型，占比達60.61%(20/33)，未檢出K54血清型，與魏丹丹等[17]報道類似。可能與K1、K2型肺炎克雷伯菌莢膜合成能力較強、可拮抗吞噬細胞吞噬作用等因素有關。多位點序列分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌感染主要表現為ST23型(51.52%，17/33)，這也是社區獲得性肝膿腫的主要肺炎克雷伯菌血清型，與蘇桂新等[18]文獻報道基本相似。

抗生素檢出分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌對環丙沙星、左氧氟沙星等8種抗生素陽性率均高于普通肺炎克雷伯菌，ESBLs陽性率明顯低于普通肺炎克雷伯菌，說明高毒力肺炎克雷伯菌對ESBLs耐藥性明顯低于普通肺炎克雷伯菌，同時出現多重耐藥性，給臨床抗感染治療造成困難。

本文研究結果表明，臨沂地區高毒力肺炎克雷伯菌多為社區獲得性感染，莢膜血清以K1與K2型為主，絕大多數攜帶rmpA毒力基因，ST23為主要流行菌株，對常用抗生素高度敏感，同時檢出ESBLs陽性菌株與碳氫霉烯類耐藥菌株。臨床醫生應分析高毒力肺炎克雷伯菌感染臨床特征、分子特征及抗生素耐藥性情況，給予早期診斷與治療。