不同地區大曲中可培養細菌的分離與鑒定

滿都拉，鄭逸飛，孫子羽，陳忠軍

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院 釀酒工程系，內蒙古 呼和浩特 010018）

大曲是指以小麥、大麥和豌豆等為主要原料，經粉碎、制坯和培菌制成的釀酒糖化劑和發酵劑，為長方體形狀的粗酶制劑[1]，是一種囊括多種微生物和微生物酶的“多酶多菌共酵體系”[2]。在白酒生產中，大曲作為糖化發酵劑被大量使用，在某些類型的白酒生產中添加量甚至高達50%以上。大曲的產地、配方、原料、生產時間以及生產工藝的不同，會導致大曲的理化性質不同[3-4]。這些理化性質的差異，會導致微生物種類的差異[5-6]，直接影響成品酒的酒體風格及品質。業內一直有“曲為酒之骨”的說法，可見大曲在白酒生產過程中的重要性。

大曲含有多種微生物，包括霉菌，酵母，細菌和少量放線菌，在這些微生物的共同作用下，使淀粉轉化成了酒精，并產生了復雜的風味。研究顯示大曲中主要的細菌有 Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus 和Enterobacteriaceae 等屬[5-8]。其中 Bacillus 屬細菌可以產生淀粉酶和蛋白酶，能夠水解原料中淀粉和蛋白質，在白酒的風味方面有極重要的作用[9]。大曲的香氣是一種復合型香氣物質，是在多種微生物共同作用下，經過培菌發酵和入庫貯存兩個階段形成的[10]。相當部分的香氣來源是細菌，例如生成濃香型白酒風味主要香味成分己酸乙酯前體物質己酸[11]，乙酸和乳酸等[12]。

不同地區的大曲的細菌種類及組成有較大差別，不同產區的大曲原料組成、工藝、氣候不同，是影響大曲中的細菌種類的重要因素。大曲作為白酒的主要原料之一，欲開發新產品，或者改良大曲，控制大曲中的細菌是一重要環節。為推動大曲細菌菌群的研究，本文以不同地區大曲為研究對象，比較研究不同地區大曲中可培養細菌的種類，為進一步研究大曲與白酒風味形成機理及改良大曲提供材料及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種大曲分別采自四川成都、山東濟寧和遼寧錦州某酒廠；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；氯化鈉（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒：杭州微生物試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane，Tris，≥99 %）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，≥99%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；冰醋酸（分析純）：天津化學試劑有限公司；DNA Marker（D2000）：天根生化科技（北京）有限公司；16SrDNA 引物（27f 與 1942R）及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒：生工生物（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2DF 雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DPX-9162B-1 恒溫培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；DYY-6D 臥式電泳儀、WD-9403X藍光觀察儀：北京六一生物科技有限公司；ABI Veriti96PCR 儀：賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-IID 超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；NU-C200RE 離心機：NuAire Laboratory Equipment；pH 計（PB-10）：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHG-9023A 烘干箱：上海篤特科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基及溶液配制

LB 固體培養基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取粉、1.0%氯化鈉、2%瓊脂、pH 7.0、121℃滅菌 20 min；50×TAE 緩沖液：24.2% Tris、5.71 %冰醋酸（mL/mL）、3.72%EDTA；1×TAE 緩沖液：稀釋 50×TAE 緩沖液。

1.3.2 樣品處理

中間部位縱向切塊約100 g，包含曲皮到曲心的全部內容物，用研缽研碎后得大曲粉。

1.3.3 樣品pH 值測定

將1.0 g 大曲粉溶于100.0 mL 蒸餾水中，使用pH計測定pH 值。

1.3.4 樣品含水量測定

將10 g 大曲粉置于平皿中，稱重，烘至恒重，稱重，計算含水量。

1.3.5 樣品密度測定

將大曲塊用保鮮膜包裹做防水處理，置于裝有50.0 mL 水的100 mL 量筒中，使大曲塊完全沒入水面之下，讀取量筒水面高度，與初始液面高度的差值即為大曲塊體積，稱重獲得大曲塊質量，計算密度。

1.3.6 可培養細菌分離

取大曲粉1.0 g 溶于無菌水中，振蕩混勻溶解；于試管中分別加注9.0 mL 蒸餾水滅菌后冷卻；在無菌操作臺使用移液槍吸取1.0 mL 樣本溶液于試管中，混勻，之后依次從前一試管中吸取1.0 mL 液體加入下一試管中混勻，稀釋到 10-5。選取 10-3、10-4、10-5，使用經過滅菌的涂布棒在培養基上進行涂布后置于30℃恒溫培養箱中培養16 h。

1.3.7 可培養細菌純化

待稀釋涂布培養基菌落出現后，使用接菌環分別挑取每個平板上所有形態及顏色不同的單菌落進行劃線，同時對這些菌落進行記錄和編號；將培養皿置于30℃培養箱中培養16 h。平板中長出菌落后，挑取單菌落再次純化，重復3 次，3 次后若出現其他菌落，則繼續進行純化，直到無雜菌出現。

1.3.8 可培養細菌細胞形態觀察

滴一滴香柏油于載玻片的菌斑上，置于顯微鏡載物臺上觀察；調節顯微鏡直到視野內出現清晰的單細胞，記錄革蘭氏染色特征，記錄菌體特征。

1.3.9 菌體收集

將純化后的細菌接種于液體LB 培養基中，30℃震蕩培養箱中培養24 h，使用紫外分光光度計檢驗菌液 OD600值達到 2.0 左右時，15 000 r/min 離心 1 min 獲得菌泥。

1.3.10 細胞破碎

分別利用兩種方式破碎細胞，反復凍融法：-80℃冷凍+90℃水浴反復凍融3 次；超聲破碎法：350 W 超聲破碎，5 s 工作+5 s 間歇，超聲破碎總工作時長15 min，全過程30 min。

1.3.11 16SrRNA 擴增及電泳

PCR 條件為：第一階段，94.0℃持續 10.0 min。第二階段，95.0℃持續0.5 s 后55.0℃持續0.5 s，再在72.0℃持續1 min 30 s。第二階段循環30 次。第三階段，72.0℃持續 10 min 后 16.0℃持續。PCR 完成后，將PCR 產物按順序加入瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓為120 V，電泳時間30 min。完成后置于藍光觀察儀下觀察條帶，根據Marker 確定片段長度。

1.3.12 PCR 產物測序及系統發育樹構建

將PCR 擴增產物送至生工生物（上海）有限公司進行測序。序列返回后，登錄NCBI 網站利用BLAST工具進行序列比對。利用MEGA7 軟件中的Neighbor joining Tree 方法構建系統發育樹。

1.4 含水量及密度的計算

1.4.1 含水量的計算

通過測定大曲初始質量（m1）和烘干恒重質量（m2），以下面公式計算大曲含水量（%）。

式中：M 為含水量，%；m1為初始質量，g；m2為烘至恒重時質量，g。

1.4.2 密度的計算

通過測定大曲質量（m）和該質量的體積（v），以下面公式計算大曲密度（g/cm3）。

式中：ρ 為密度，g/cm3；m 為質量，g；v：體積，cm3。

2 結果與分析

2.1 不同地區大曲基本理化指標

不同地區大曲pH 值、含水量及密度等基本理化指標見表1。

由表1可知四川成都大曲pH 值為6.99，含水量為9.89%，密度為0.71 g/cm3。山東濟寧大曲pH 值為6.16，含水量為10.00%，密度為0.68 g/cm3。遼寧錦州大曲pH值為6.58，含水量為11.65%，密度為0.86 g/cm3。山東濟寧大曲的pH 值最低，密度最低，四川成都大曲含水量最低，遼寧錦州大曲的密度和含水量最高。

表1 不同大曲基本理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of three dfferent Daqu

2.2 不同地區大曲中細菌的分離

3種大曲樣本中共分離出37 株可培養細菌。經過進一步確認，四川成都大曲中分離出5 株，山東濟寧大曲中分離出4 株，遼寧錦州大曲分離出6 株形態不同的菌株，結果如表2所示。

表2 3種大曲中可培養細菌細胞及菌落形態Table 2 The cell and colony morphology of the isolates from Daqu

續表2 3種大曲中可培養細菌細胞及菌落形態Continue table 2 The cell and colony morphology of the isolates from Daqu

2.3 分離菌株16SrRNA擴增及系統發育樹的構建

所分離微生物經細胞破碎及PCR 擴增后得到長度約1 500 bp 序列，符合擴增目的產物長度。經測序后，與數據庫中序列比對后，建立的系統發育樹如圖1所示。

圖1 不同地區大曲中分離細菌的系統進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of cultivable bacteria in Daqu from different regions

從圖1中可知，四川成都大曲中可培養細菌發育樹分為兩個大簇。第一大簇包括Bacillu 和Staphylococcus 兩個屬。其中 Bacillus 屬中包括一株 B.licheniformis（DQA-3A5A）和兩株Bacillus 屬的細菌（DQA-3A3 和 DQA-4C3R），Staphylococcus 屬中一株菌屬于S.saprophyticus（DQA-3A7B）。第二大簇中僅有一個Pantoea 屬菌株（DQA-3A9R2）；山東濟寧大曲中可培養細菌發育樹同樣分兩個大簇。第一大簇中包括Bacillus 和Enterococcus 兩個屬，其中Bacillus 屬中包括 B.wiedmannii（DQB-A1BB）和 B.tequilensis（DQB-5A6R）兩個菌株，Enterococcus 屬中僅有一株E.lactis（DQB-5A2B）。第二大簇中僅包括一個Pseudomonas屬的細菌（DQB-5A1B）；遼寧錦州大曲中可培養系統發育樹也可分為兩個大簇。第一大簇中包括Acinetobacter 和 Enterococcuss 兩個屬，其中 DQC-B1、DQCC1 和 DQC-C2 均屬 Acinetobacter，DQC-B4 屬于 Enterococcuss 屬的E.faecalis。第二大簇中兩株菌（DQCA1 和 DQC-B3）均屬于 Enterobacter 屬細菌。

3 討論與結論

不同原料、生產環境及生產時間對大曲中微生物均有影響[5-6，13]。本研究中從四川成都大曲中分離出細菌中有3 株屬于Bacillus 屬，其中DQA-3A5A 是一株B.licheniformis。報道顯示該類細菌可以分泌多種具有淀粉水解能力的酶，促進淀粉轉變為可發酵糖類，作為酒精發酵階段產生底物[2]。另外，Bacillus 屬細菌可在固態發酵過程中代謝產生苯乙醛、糠醛、庚醇、呋喃扭爾、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚、吲哚、2-戊基呋喃、三甲基吡嗪、2，3-丁二醇、異戊酸、苯甲醛、2-甲基-2-丁烯酸、四甲基吡嗪、β-苯乙醇和苯乙酸等多種風味物質[14]。因此，Bacillus 屬細菌在白酒固態發酵過程中起到的重要作用。DQA-3A9R2 是一株Pantoea 屬細菌，該屬細菌多見于植物中，是一類條件致病菌。劉洋等[15]在超級水稻種子中發現該類細菌是超級水稻種子中的主要優勢菌種，所以該類微生物或由谷物原料帶入。DQA-3A7B 是一株S.saprophyticus，是肉類發酵食品中的常見微生物之一[16]。竇曉等在研究瀘香型大曲中也發現了該類微生物[17]。

在山東濟寧大曲中發現B.wiedmannii 和B.tequilensis 兩株芽孢桿菌屬細菌。芽孢桿菌（B.wiedmannii）在大曲中是一類極重要的細菌，占菌群數量的50%以上。B.tequilensis可分泌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶可以對β-葡聚糖進行分割，破碎禾本植物種子的胚乳細胞壁，使禾本植物胚乳中的淀粉充分釋放出來參與發酵，在固態發酵過程中起重要輔助作用[18]。乳酸菌（Lactobacillus）是大曲中的常見菌[19]。E.lactis（DQB-5A2B）屬乳酸菌，在固態發酵的過程中，如果乳酸菌生成適量乳酸，通過蒸餾進入酒體后，有利于改善白酒的風味。這種情況下，乳酸菌可歸屬于白酒釀造有益細菌[20]。但是，如果料醅中的乳酸菌過多，活力較強，加上環境溫度等條件適宜，將會產生過多的乳酸，生成乳酸乙酯較多，導致白酒的口感較差，此時的乳酸菌可被視為有害細菌[21]。Pseudomonas（DQB-5A1B）屬細菌一般是條件致病菌，經常導致制曲工人出現皮膚感染等職業病。遼寧錦州產大曲中發現多株Acinetobacter 屬，其中 DQC-B1，DQC-C1 和 DQC-C2 均為 A.johnsonii，該屬細菌廣泛存在于環境中，耐受性較強。報道顯示，Acinetobacter 屬主要出現在管路和器械的表面中[22]。E.faecalis（DQC-B4）多見于植物發酵食品中，例如泡菜等，也是一種條件致病菌。在植物發酵食品有害微生物安全分析研究中發現，E.faecalis 在葉菜類和果菜類食品中檢出數較多[23]。

綜上所述，不同地區、原料對大曲中可培養微生物影響較大，芽孢桿菌是常見的一類存在于大曲中的微生物，能夠提供多種酶類，是發酵有益菌。但在傳統制曲過程中一些治病或非發酵細菌也在本研究中發現。因此，優化生產工藝提高有益微生物量，降低不利微生物的繁殖是進一步優化傳統大曲的一個研究方向。