外源香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態建成與解剖結構的影響

陶 茸，師尚禮，張翠梅，陳建綱，王曉瑛

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

根系不僅是植物吸收水分和礦質營養的重要器官，也是最先感受土壤逆境脅迫的重要部位，其生長發育是遺傳因子、外部生物和非生物因素共同刺激作用的結果[1-3]。結構是功能的基礎，植物結構的變化必然會影響到生理生態功能的改變，而根系解剖結構是根系發育水平的直接體現，與生理功能關系密切，木質化程度、輸導組織、表皮的附屬結構等會影響植物抵抗逆境的能力[1,4-5]。植物的防御準備過程在啟動了分子信號的同時，也會分泌植物抗毒素—香豆素[6]。陶茸、蔡登高等[7,8]指出香豆素不僅影響苜蓿種子萌發，還影響其幼苗氮代謝和氨同化的關鍵酶，導致苜蓿體內養分缺失。王婧怡等[9]發現100 μg·mL-1的香豆素水溶液通過改變蘇丹草(Sorghumsudanense)抗氧化酶系統、影響酶活性、破壞細胞超微結構等途徑調節蘇丹草的生長，姚丹丹[10]則認為該濃度下的香豆素水溶液只能在多花黑麥草(Loliummultiflorum)種子發芽和幼苗生長初期可以很大限度地起到抑制作用，但不足以致死。也有研究表明，40 μg·mL-1的香豆素水溶液能顯著抑制紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、多花黑麥草、紅三葉(Trifoliumpratense)、萵苣(LactucasativaL.)、萹蓄(PolygonumaviculareL)、銅綠微囊藻(Aeruginosa)等植物種子萌發和幼苗生長[11-14]。咖啡酸在一定濃度下能夠誘導萵苣體內活性氧的產生和積累，降低幼苗根尖細胞活力，進而影響萵苣幼苗的生長發育，對銅綠微囊藻也具有明顯的生長抑制效應[15-16]。

苜蓿作為多年生優質豆科牧草，具有一次種植、多年收獲、產草量高、營養豐富和適口性好等特點，有“牧草之王”之稱[7]，田晨霞等[17-19]研究了紫花苜蓿葉片及根系的形態和解剖結構對鹽堿脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫以及氮素水平的適應反應，從不同程度揭示了土壤環境對苜蓿葉片和根系的脅迫可能造成葉片、根系形態建成及內部輸導組織結構的適應性改變，從而影響植物對養分的吸收和利用。也有研究表明，連茬種植的苜蓿種子由于自毒作用不能正常發育，很難建植成功[20]。香豆素、綠原酸、香豆酸、羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等酚類物質是造成紫花苜蓿自毒作用的主要物質[21-26]，在苜蓿植株體內隨著生育時期而不斷累積[27-28]，對多數植物的萌發和生長產生抑制作用。然而香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態建成與解剖結構的影響鮮見報道，本研究采用營養液沙培法研究紫花苜蓿主要自毒物質香豆素、咖啡酸及兩者混合物對紫花苜蓿生長早期根系形態建成與解剖結構的影響，揭示紫花苜蓿根系外部形態與解剖結構之間的相關性，以期為深入探討香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿生長和發育影響的機理提供依據，為有效緩解和解決苜蓿自毒障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘農9號紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Gannong No.9’)，由甘肅農業大學草業學院實驗室提供，發芽率為96.83%。

藥劑:香豆素(Coumarin)、咖啡酸(Caffeic acid)均為分析純品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，混合物由香豆素、咖啡酸按1∶1比例配制，試驗設計中香豆素、咖啡酸及其兩者混合物分別用字母C，CF和M表示(見表1)。

1.2 試驗方法

試驗在甘肅農業大學草業生態系統教育部重點實驗室進行，采用營養液沙培法，選用經高溫滅菌(121℃，6 h)的等量細沙，將其裝入營養缽(下口內徑12 cm，上口內徑18 cm，高度為15 cm)中，擺放在水培盒(長×寬×高為45 cm×18 cm×10 cm)中，置于光照培養室(每天光照14 h，光通量密度400 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度分別為(25±1)℃和(20±1)℃，相對濕度60%左右)[29]。將供試種子經75%酒精消毒后選30粒均勻播種在營養缽中，出苗后間苗，每缽保留生長一致的幼苗20株，每3 d澆灌Hoagland營養液300 mL，確保幼苗正常生長，于幼苗4葉期(播種10 d后)每處理施加以Hoagland營養液為母液的外源香豆素、咖啡酸及混合酚酸處理液600 mL進行處理，處理液濃度梯度依據前人研究結果[6-11]，結合預試驗設定為0.5，5，50，500 mg·L-1(詳見表1)，以施加600 mL不添加外源香豆素和咖啡酸的Hoagland營養液處理為對照(CK)，每處理重復3次。為確保花盆處理液濃度保持不變，每隔1 d給培養盒新添加處理液至600 mL，每7 d用蒸餾水淋洗1次培養盒，并施加新配置營養液。連續處理28 d時，選擇3個長勢基本一致的植株根進行取材，取根莖下1～2 cm處根段，立即放入FAA固定液(70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL)中，固定24 h以上[18]，分別測定根粗、皮層厚度、中柱直徑、導管數量及面積等解剖結構指標。

表1 香豆素和咖啡酸處理配比Table 1 The treatments of coumarin and caffeic acid

1.3 測定指標與方法

1.3.1根系形態指標 用蒸餾水洗凈各處理根系，置于盛有去離子水的無色透明水槽中，用鑷子調整根位置避免交叉重疊，使用臺式掃描儀(EPSON Experssion)進行掃描，再用根系分析系統(Win Rhizo Pro 2004a)分析掃描的圖片，獲得根系總長度、根表面積、總根體積和根平均直徑等形態指標相關數據，每處理重復3次。

1.3.2根系解剖結構 利用石蠟切片技術觀察苜蓿幼苗根系解剖結構，參考李正理[30]、李和平[31]的方法對所取材料進行固定、脫水、透明、滲蠟、包埋、切片、脫蠟與復水、染色和封片。使用生物光學顯微鏡(Zeiss Axioskop40 Germany)觀察石蠟切片中根系解剖結構，并用Axio-Vision軟件測量與計算維管束、導管面積、表皮厚度、皮層厚度等，每個處理選取3個樣本，每個樣本隨機取10個視野求平均值，并記錄導管數量[18]。

1.3.3自毒效應敏感指數(The allelopathic response index，RI)，采用Williamson[32]公式

RI=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

其中C為對照值，T為處理值，當RI>0時，為促進作用；當RI<0時，為抑制作用，RI絕對值的大小表示自毒作用強度。

自毒綜合效應((The synthetical autotoxicity effects，SE)：表示自毒作用的綜合效應，SE是供體對同一受體多個測試項目的自毒效應敏感指數RI的算術平均值[33-34]。

1.4 數據分析

用Excel 2010應用軟件進行數據整理，并制作圖表；采用SPSS 19.0統計軟件進行數據統計分析，采用Duncan法進行顯著性比較；采用Photoshop CS 8軟件進行圖片合成。

2 結果與分析

2.1 外源香豆素和咖啡酸對苜蓿幼苗根系形態建成的影響

2.1.1對苜蓿幼苗根長的影響 由圖1可以看出，與對照相比，紫花苜蓿總根長在高于5 mg·L-1的C處理和高于50 mg·L-1的CF及M處理下顯著降低(P<0.05)。紫花苜蓿根長隨著C處理濃度的升高而降低，50 mg·L-1和500 mg·L-1處理與對照相比分別降低18.78%和82.35%，差異顯著(P<0.05)。CF處理濃度在0～50 mg·L-1范圍內，紫花苜蓿總根長隨著處理濃度的升高而增長，但與對照相比差異不顯著(P>0.05)，當其處理濃度增至500 mg·L-1時，苜蓿幼苗根系嚴重發黑、干枯、腐爛。當M處理濃度為0.5 mg·L-1時，苜蓿根系總長與對照相比提高11.09%，但差異不顯著(P>0.05)，總根長隨著處理濃度的升高而降低，當處理濃度增至500 mg·L-1，總根長顯著降低(P<0.05)，比對照降低61.63%。

2.1.2對苜蓿幼苗根表面積的影響 C，CF及M處理對紫花苜蓿根表面積的抑制作用在高濃度下更明顯(圖2)。當處理濃度低于50 mg·L-1時，3種外源添加物對苜蓿幼苗根表面積的抑制作用不明顯，與對照相比差異均不顯著(P>0.05)，當添加物濃度增至500 mg·L-1，C，CF及M處理下苜蓿幼苗根表面積與對照相比分別降低45.77%，22.47%和42.34%，均差異顯著(P<0.05)。綜上，500 mg·L-1及以上濃度的香豆素、咖啡酸及其混合物處理顯著抑制紫花苜蓿根表面積的增加。

圖1 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿總根長的影響Fig.1 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root length of alfalfa注：不同小寫字母注釋添加物與對照間差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different small letters indicate significant difference between additions and controls at the 0.05 level. The same as below

圖2 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿總根表面積的影響Fig.2 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root surface area of alfalfa

2.1.3對苜蓿幼苗根體積的影響 如圖3所示，紫花苜蓿根體積在高濃度C，CF處理下與對照相比顯著降低(P<0.05)，低濃度處理下與對照相比差異不顯著(P>0.05)，M處理紫花苜蓿根體積生長的趨勢呈現出明顯的低促高抑，C處理的濃度為50 mg·L-1時，紫花苜蓿根尖發黑、根變形嚴重、增粗、體積最大，但與對照相比差異不顯著(P>0.05)，當其處理濃度增至500 mg·L-1時，其根嚴重受損，體積顯著低于對照71.15%(P<0.05)。CF處理濃度為50 mg·L-1及以上時，紫花苜蓿的根體積比對照降低了34.23%，差異顯著(P<0.05)。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理使紫花苜蓿根體積比對照增加了45.79%，差異顯著(P<0.05)，但其根體積隨著處理濃度的升高而減小，當其處理濃度增至50 mg·L-1時，根體積比對照降低了26.17%，差異顯著(P<0.05)。綜上，CF和M處理抑制苜蓿根體積增大的臨界濃度是50 mg·L-1，C處理是500 mg·L-1，但C處理的苜蓿根在50 mg·L-1濃度下，嚴重畸形、增粗、表皮粗糙甚至破裂，不利于苜蓿根系正常生長。0.5 mg·L-1的M處理顯著促進了苜蓿根體積增加。

圖3 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根體積的影響Fig.3 Effects of coumarin and caffeic acid on the root volume of alfalfa

2.1.4對苜蓿幼苗根尖數的影響 與對照相比，高濃度的C和CF處理顯著降低了苜蓿的根尖數，M處理對苜蓿根尖數表現出低濃度促進，高濃度抑制趨勢(圖4)。C處理下，50，500 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數比對照分別降低了40.47%和90.15%，差異均顯著(P<0.05)。CF處理下，500 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數比對照降低了56.5%，差異顯著(P<0.05)，其余處理與對照差異均不顯著。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數比對照增長了42.67%，隨著處理濃度的增加，根尖數逐漸減少，當處理濃度增至500 mg·L-1時，根尖數比對照減少了67.03%，差異顯著(P<0.05)。綜上所述，高于50 mg·L-1的C處理和高于500 mg·L-1的CF，M處理均顯著抑制苜蓿根尖數的增長，而0.5 mg·L-1的M處理顯著增加了苜蓿根尖數，促進苜蓿根尖生長。

圖4 香豆素、咖啡酸對紫花苜蓿根尖數的影響Fig.4 Effects of coumarin and caffeic acid on the number of alfalfa root tip

2.2 外源香豆素、咖啡酸對苜蓿幼苗根系解剖結構的影響

2.2.1對根粗的影響 由圖5可知，C，CF和M處理在低濃度時，對苜蓿根直徑的增加有一定的促進作用，高濃度處理時均表現出顯著的抑制作用。C處理下，隨著處理濃度的逐漸增大，苜蓿根直徑逐漸增大，50 mg·L-1的濃度處理時，苜蓿根直徑比其對照增長了14.56%，差異顯著(P<0.05)，但根畸形增粗，表皮粗糙甚至破裂。當其濃度增至500 mg·L-1時，根嚴重受損，干枯，腐爛嚴重，根直徑減小，顯著低于對照處理(P<0.05)。CF處理下，50 mg·L-1及高于該濃度作用時，苜蓿的根直徑明顯減小，比對照降低12.03%，且差異顯著(P<0.05)。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理明顯促進苜蓿根直徑增長，使其根直徑比對照增加9.89%，隨著處理濃度的增加，苜蓿根直徑逐漸降低，當其濃度增至50 mg·L-1時，苜蓿根直徑直線下降，比對照顯著降低20.52%(P<0.05)。綜上，CF和M處理抑制苜蓿根粗增大的臨界濃度是50 mg·L-1，C處理是500 mg·L-1，但C處理的苜蓿根在50 mg·L-1濃度作用下，嚴重畸形、增粗、表皮破裂嚴重。500 mg·L-1濃度處理下，C，CF和M處理的苜蓿根直徑均顯著降低。

圖5 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根粗的影響Fig.5 Effects of coumarin and caffeic acid on the root diameter of alfalfa

2.2.2對根皮層發育的影響 C，CF和M處理作用于苜蓿根系，根皮層厚度呈現低濃度降低高濃度增加的趨勢，與皮層厚度與根半徑之比的變化趨勢基本一致，但不同處理間存在差異性(圖6)。C處理下，50 mg·L-1濃度時，皮層厚度顯著增大，皮層細胞排列緊密，比對照增加2.94%，且差異顯著(P<0.05)，500 mg·L-1濃度處理的皮層厚度與根半徑之比最大，比對照高14.75%，且差異顯著(P<0.05)。CF處理下，50 mg·L-1濃度時，皮層厚度與根半徑之比顯著高于對照，當處理濃度增至500 mg·L-1時，苜蓿皮層厚度、皮層厚度與根半徑之比均最大，分別比對照提高31.81%和61%，且差異顯著(P<0.05)。M處理下，500 mg·L-1濃度時，苜蓿皮層厚度、皮層厚度與根半徑之比分別比對照提高25.88%和37.11%，差異顯著(P<0.05)，0.5 mg·L-1濃度時，皮層厚度與根半徑之比顯著低于對照(P<0.05)。可見，紫花苜蓿在較高濃度的自毒物質香豆素、咖啡酸和混合物作用下，增加根部皮層厚度抵制外源添加物的抑制作用，進而調節自身生長和發育。C處理使根皮層厚度明顯增加的臨界值為50 mg·L-1，CF和M的臨界值為500 mg·L-1，表明在較高濃度處理時，C處理對苜蓿根皮層的抑制作用高于CF和M處理近10倍。

2.2.3對根系中柱發育的影響 3種外源添加物濃度低于5 mg·L-1的處理對苜蓿根中柱直徑的影響均不明顯，但導管數量及面積因外源添加物的種類不同呈現出不同的規律，隨著添加物濃度的增加，苜蓿根中柱直徑、中柱直徑與根直徑之比均呈現明顯降低的趨勢(圖7)。C處理下，添加物濃度為50 mg·L-1時，導管數量增加25.89%，中柱直徑與根直徑之比降低，均與對照差異顯著(P<0.05)。CF處理下，添加物濃度為5 mg·L-1時，導管數量和導管面積比其對照分別提高了36.84%和33.4%，且差異顯著(P<0.05)，當濃度增至50 mg·L-1時，其根中柱直徑，中柱直徑與根直徑之比較對照分別顯著降低33.81%和24.65%(P<0.05)，但導管數量和導管面積與對照差異不顯著(P>0.05)。M處理下，添加物濃度為0.5 mg·L-1時，苜蓿根中柱直徑、導管數量和導管面積均最大，較其對照分別增加26.4%，35.2%和37.49%，顯著高于對照。當其處理濃度增至50 mg·L-1及以上時，苜蓿的根中柱直徑、中柱直徑與根直徑之比及導管數量均顯著低于對照處理(P<0.05)，可見，低濃度(0.5 mg·L-1)的M處理明顯促進了根中柱內導管的發育，使根變粗、根系發達。綜上所述，當3種外源添加物濃度為50 mg·L-1時，苜蓿根中柱直徑與根直徑之比均顯著降低，C處理的導管數量顯著增加，CF處理導管面積顯著增加，M處理的導管數量和面積均顯著降低。

圖7 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根中柱的影響Fig.7 Effects of coumarin and caffeic acid on the root stele of alfalfa

2.3 外源香豆素、咖啡酸對苜蓿幼苗根系形態建成和解剖結構的自毒及綜合效應

如表2所示，香豆素、咖啡酸及其混合物對苜蓿根外部形態和內部解剖結構的自毒效應不同，同種外源添加物對苜蓿根外部形態和內部解剖結構的自毒作用強度與濃度密切相關。C處理下，0.5 mg·L-1濃度時，苜蓿根外部形態(總根長除外)、內部解剖結構(導管數除外)的RI>0，表明0.5 mg·L-1的C處理對苜蓿總根表面積、根體積、根尖數、根粗、中柱直徑/根直徑及導管面積的發育均有促進作用。添加物濃度在5～50 mg·L-1時對苜蓿根粗和導管數量與對照相比有顯著促進作用，但對總根長和根尖數有顯著抑制作用(P<0.05)。CF處理下，5 mg·L-1及低于該濃度時，苜蓿根外部形態(根尖數除外)的RI>0，5 mg·L-1濃度處理時苜蓿內部解剖結構的RI>0，表明較低濃度的CF作用下，除根尖數外，苜蓿根外部形態，各項指標均得到促進，5 mg·L-1時苜蓿內部解剖結構的各項指標均得到促進；50 mg·L-1濃度時，對苜蓿根體積、根粗及中柱直徑/根直徑與對照相比有顯著抑制作用，對導管數和導管面積有顯著促進作用(P<0.05)。M處理下，5 mg·L-1及低于該濃度時，對苜蓿根外部形態和內部解剖結構均表現為促進作用，其中對苜蓿根體積、根尖數、根粗和導管數的促進作用與對照相比差異顯著，50 mg·L-1及高于該濃度時，對苜蓿根外部形態和內部解剖結構均表現為抑制作用，其中對苜蓿根體積、根粗、中柱直徑/根直徑及導管數與對照相比呈現出顯著抑制作用(P<0.05)。當外源添加物的濃度增加至500 mg·L-1時，C，CF和M處理苜蓿幼根均發黑，出現嚴重損傷和腐爛，顯著抑制苜蓿根外部形態和解剖結構。綜上所述，M處理對苜蓿幼根外部形態和解剖結構呈現出明顯的低濃度促進、高濃度抑制的作用，C和CF處理整體呈現高濃度(500 mg·L-1)抑制的效應。

表2 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態和解剖結構的自毒效應Table 2 Autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology and anatomical structure of alfalfa

注：*表示與對照之間差異顯著，P<0.05

Note:* in the table indicate significant difference at the 0.05 level compared to the control

圖8 ‘甘農9號’紫花苜蓿不同外源添加物處理下根解剖結構圖Fig.8 Root anatomical structure photograph of 'Gannong No.9' alfalfa under different exogenous additives

圖9 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態(左)和解剖結構(右)的自毒綜合效應Fig.9 Comprehensive autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology(left) and anatomical structure(right) of alfalfa注：圖中不同小寫字母表示C,CF和M處理間的差異性，P<0.05Note：Different small letters indicate significant difference among C,CF and M treatments at the 0.05 level

3種外源添加物對苜蓿根外部形態和解剖結構的生長發育均呈現出比較明顯的高濃度抑制效應(圖9)。當處理濃度為0.5 mg·L-1時，C和CF處理對苜蓿根外部形態具有一定的促進作用，M處理對苜蓿根外部形態和內部解剖結構具有明顯的促進作用，且均與C和CF處理差異顯著(P<0.05)。5 mg·L-1的CF和M處理均促進苜蓿根外部形態和內部解剖結構的生長和發育，但兩者之間差異不顯著，該濃度處理下C對苜蓿根外部形態發育表現出抑制作用。隨著處理濃度的增加，CF和M對兩類指標均表現出抑制作用，但50 mg·L-1的C處理對苜蓿根解剖結構具有促進作用，并與M處理差異顯著，這主要是因為該處理下苜蓿根粗和導管數量明顯增加所致，然而中柱內細胞排列混亂且存在畸形(圖8)，反而不利于根對水分和養分的吸收，使其根長和根尖數顯著低于對照(P<0.05)。當處理濃度增至500 mg·L-1時，3種添加物對苜蓿幼根各項指標的抑制效應最強，C，CF和M處理對苜蓿幼根外部形態的自毒綜合效應指數分別為-0.73，-0.41和-0.58，對苜蓿根內部解剖結構的自毒綜合效應指數分別為-0.46，-0.26和-0.42，其中C處理對苜蓿根各項指標的抑制效應顯著強于CF處理，M處理對苜蓿根內部解剖結構的抑制效應顯著強于CF。綜上所述，3種外源添加物對苜蓿的根外部形態和內部解剖結構的自毒抑制綜合效應由強到弱依次為：C處理>M處理>CF處理。

3 討論

本研究結果表明，較高濃度(50 mg·L-1)外源香豆素、咖啡酸及其混合物處理苜蓿幼苗，其幼根皮層厚度及皮層厚度與根半徑之比均有增加現象，可能是在該濃度處理下紫花苜蓿通過增加根部皮層厚度來抵制外源香豆素和咖啡酸對其抑制作用，進而調節自身生長和發育。植物木質部中的導管，主要起輸導水分和支持作用，趙祥等[35]認為，導管大有利于植物體內水分運輸從而抵御干旱逆境，50 mg·L-1濃度的CF處理下苜蓿中柱直徑與根直徑之比降低，但導管數量和面積均顯著增加，可見，苜蓿在較高濃度外源咖啡酸作用下，可以通過增加導管的數量和面積來運輸和篩選水分、無機鹽，降低較高濃度咖啡酸對苜蓿的抑制作用，為自身正常生長提供保障。該結果與劉延吉等[36]研究的玉米(ZeamaysL.)可通過根內維管柱徑向加粗、增加導管數量，以提高根的運輸能力，適應低鉀脅迫逆境的現象不完全一致，這可能是由于研究對象和外源添加物不一致所致。植物自毒作用的一個重要機制是自毒物質通過影響受體植物細胞有絲分裂來促進或抑制其生長發育[37]，香豆素、咖啡酸及其混合物能夠促進或抑制苜蓿幼根的形態建成和解剖結構，可能也是通過干擾苜蓿根尖細胞有絲分裂所致，其影響機制還有待進一步研究。

植物形態結構與所處環境密切相關，為了能在不同的生境中生長和發育，植物往往呈現出不同的形態結構，這通常被認為是植物對特殊生境的演化適應。本研究表明在香豆素、咖啡酸及其混合物的種類和濃度綜合作用下，紫花苜蓿生長早期根系內部解剖結構與外部形態的可塑性存在一定相關性：低濃度(0.5 mg·L-1)混合物處理不僅顯著增大苜蓿根體積和根尖數量，提高根系向所處環境攝取自身所需營養物質的能力，而且顯著促進苜蓿幼根皮層、中柱、導管等解剖結構的發育(P<0.05)，增強根系通氣和輸導水分、無機鹽的能力，進而形成了高效吸收和運移的良性循環體系，但香豆素和咖啡酸處理對苜蓿根外部形態和內部解剖結構的促進作用與對照相比差異不顯著(P>0.05)。在低于50 mg·L-1的濃度處理下，紫花苜蓿幼根通過改變根系外部形態建成及改善其內部輸導組織結構來適應香豆素、咖啡酸及其混合物的刺激作用，確保幼苗正常生長發育，但高于該濃度處理時，苜蓿根系形態建成和解剖結構均受到顯著抑制效應，且自毒抑制效應由強到弱均為：香豆素>混合物>咖啡酸。可見，香豆素和咖啡酸的混合物在低濃度時增強了單體香豆素和咖啡酸對苜蓿幼根外部形態及內部解剖結構的促進作用，高濃度時降低了單體香豆素對紫花苜蓿幼根外部形態和內部解剖結構的抑制作用，該現象可能是由于香豆素和咖啡酸之間存在一定協同作用，而這種協同作用可能和外源添加物種類及其組成密切相關，也可能是混合物刺激苜蓿分泌某種新物質所致，該現象產生的可能原因有待進一步研究。

4 結論

苜蓿的根系外部形態和解剖結構對不同濃度香豆素、咖啡酸及其混合物存在相同或不同的響應機制：低濃度(0.5 mg·L-1)的香豆素和咖啡酸混合物處理對苜蓿幼根皮層、中柱、導管等解剖結構的發育呈現出顯著的促進作用，增強單體香豆素和咖啡酸的促進作用。低于50 mg·L-1濃度的香豆素、咖啡酸及其混合物誘導紫花苜蓿根系產生不同程度的結構性改變以適應生長環境，但高于該濃度時，其根系受損嚴重，不能正常生長和發育。高濃度(500 mg·L-1)香豆素、咖啡酸及其混合物對苜蓿幼根外部形態和內部解剖結構的自毒抑制綜合效應由強到弱依次為：香豆素>混合物>咖啡酸。本研究從根系形態建成和解剖結構層面解釋了紫花苜蓿主要自毒物質香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿幼苗生長和發育的自毒作用，為深入探討香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿生長和發育影響機理提供依據。