不同利用方式對內(nèi)蒙古羊草草原氨氧化微生物豐度的影響

朱 蕊，陳 清，馬成倉，王中良

(1. 天津師范大學天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387；2. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387)

羊草(Leymuschinensis)草原是北方典型草原區(qū)和草甸草原區(qū)的重要草地資源類型之一，具有重要的生態(tài)功能和經(jīng)濟價值[1]。目前，由于人類對草地的不合理利用，改變草原生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)(如氮素循環(huán)[2])，造成營養(yǎng)物質(zhì)流失和草原的大面積退化[3-4]。圍封作為退化草地恢復的一種重要手段在草原區(qū)得到廣泛應(yīng)用[5-6]。草地管理方式改變?nèi)绾斡绊懙氐纳锏厍蚧瘜W循環(huán)，進而影響草原生態(tài)系統(tǒng)功能是一個廣泛關(guān)注的問題。硝化作用在地球氮素循環(huán)中具有重要作用，是固氮和反硝化作用的中心環(huán)節(jié)，它決定了氮素對植物的有效性[7]。氨氧化過程是將氨氧化為亞硝酸的過程，是硝化作用的第一步也是限速步驟，由氨氧化微生物氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea，AOA)和氨氧化細菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)完成[8]。草地利用方式的改變會影響AOA和AOB豐度，進而影響硝化作用和土壤氮素周轉(zhuǎn)，國內(nèi)外學者針對放牧和圍封對氨氧化微生物的影響開展了研究，結(jié)果表明不同的草地利用方式會對氨氧化微生物產(chǎn)生不同的影響[9-10]。在內(nèi)蒙古荒漠草原長期圍封處理后AOB豐度顯著增多，而AOA豐度對于土地利用變化的響應(yīng)不明顯[9]。德國西南部士瓦本山(Schwabische Alb)草原的研究發(fā)現(xiàn)，AOB非常穩(wěn)定不受土地利用強度的影響，而AOA受土地利用強度的影響顯著[10]。土地利用方式改變后，草原土壤硝化潛勢和氨氧化微生物如何變化，不同研究區(qū)域由于環(huán)境因子差異，研究結(jié)果不盡相同。目前，內(nèi)蒙古羊草草原大部分研究集中在放牧對氨氧化微生物的影響方面[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)AOA隨著放牧強度的增加而顯著增加，而AOB的豐度在不同措施下都無顯著變化[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)AOB豐度隨著放牧強度的增加顯著下降，放牧對AOA豐度無顯著影響[12]。目前，長期圍封對內(nèi)蒙古羊草草原氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的影響的研究鮮見報道。因此，本試驗以內(nèi)蒙古羊草草原為研究區(qū)域，通過分子生物學研究方法，研究不同利用方式下氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的變化趨勢，探究圍封后土壤中硝化過程轉(zhuǎn)變的微生物機制，研究結(jié)果對于理解草地圍封管理對于氮素周轉(zhuǎn)影響的機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

土樣采集于2015年8月8日，采樣地點位于內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站羊草樣地北側(cè)，錫林河流域中部(43°26′～44°29′N，115°32′～117°12′E)。該地區(qū)是溫帶典型草原，屬于半干旱草原氣候；年平均氣溫為0.7℃，冬季寒冷干燥，夏季溫暖濕潤；年平均降水量343 mm，降水集中于5-9月份，占全年降水量的80%左右，且降水的年際變化顯著。土壤為暗栗鈣土，土壤含水量為7.31%，pH為7.35～7.96，全氮含量為1.34 g·kg-1，銨態(tài)氮含量為2.18 mg·kg-1。植被以相對生物量為18%的羊草(Leymuschinensis)、34%的大針茅(Stipagrandis)、17%的糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)、13%的冰草(Agropyroncristatum)等為主[13]。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗設(shè)放牧和圍封2個處理。從2005年開始選擇地勢平坦、植被均勻有代表性的樣地進行圍封，圍封面積為0.2 ha，該圍封樣地是課題組長期水分、氮素添加的野外試驗基地[14]，該樣地在2005年之前進行了30年的連續(xù)放牧，放牧的強度約為2只羊·ha-1，并且此樣地未曾施用過任何肥料。本試驗的圍封處理是長期定位野外試驗樣地的對照處理，即不加水不加氮的單圍封處理。圍欄內(nèi)單圍封不加水和氮處理設(shè)有4個小區(qū)(即4個重復)，每個小區(qū)面積5 m×8 m。該樣地在圍欄外仍然繼續(xù)全年完全自由放牧，為本研究的自然放牧處理。2015年8月中旬進行土樣采集，圍欄內(nèi)在單圍封的4個小區(qū)采集土壤樣品，與圍欄內(nèi)對應(yīng)，圍欄外自由放牧處理隨機選擇4個樣點，即4個重復。圍欄內(nèi)每個小區(qū)和圍欄外每個采樣點使用直徑為2 cm的土鉆隨機取0～15cm的土壤5鉆，5鉆混為一份樣品，過2 mm篩，混合均勻，采用“四分法”選取部分土壤，裝入封口袋中密封，圍欄內(nèi)外一共取40鉆土，混合為8個土樣(圍欄內(nèi)外各4個)。土壤進行分裝，用生物冰袋冷藏，一部分鮮土帶回實驗室-80℃冷凍用于土壤總DNA的提取，一部分鮮土4℃保存用于硝化潛勢的測定。

1.3 指標測定

1.3.2土壤總DNA提取和PCR擴增 土壤總DNA提取采用FASTDNA?SPIN Kit for soil(Q BIOgene Inc.，Carlsbad，CA)，取500 mg土壤樣品，操作過程完全按照試劑盒說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA片段大小。氨氧化微生物選用amoA功能基因特異引物(表1)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中，正反引物各0.5μL，10×buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O 15 μL。

1.3.3克隆文庫構(gòu)建 PCR擴增產(chǎn)物進行切膠純化，將純化后產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，再通過熱激法將載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞(JM109)(TaKaRa,Dalian)，取轉(zhuǎn)化液涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)16～18 h。進行藍白斑篩選，選取大約100個白色克隆用的通用引物M13F和M13R進行菌落PCR擴增，將陽性克隆菌液送上海美吉公司進行測序分析。重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)GenBank的Blast比對,分別與已發(fā)表的AOA和AOB氨單加氧酶amoA基因序列進行多重序列比對。表明重組質(zhì)粒可以作為氨氧化微生物進行絕對熒光定量PCR分析的標準DNA。

1.3.4氨氧化微生物豐度的測定 采用實時熒光定量PCR測定土壤氨氧化古菌和細菌(AOA和AOB)的豐度，對氨氧化微生物的氨單加氧酶活性多肽位點基因(amoA基因)進行定量分析。其定量PCR均采用SYBRGreen法。AOA和AOB定量均采用定性分析所用引物(表1)。擴增體系為20 μL，包含：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,正反向引物各0.5 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 7 μL。采用ABI 7500實時定量擴增PCR儀，對氨氧化微生物進行定量分析。試驗設(shè)置陰性對照，并將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA梯度進行稀釋，得到標準曲線，每個樣品3次重復，標線和樣品的溶解曲線為單一峰。

注：F為上游引物，R為下游引物

Note：F is upstream primer and R is downstream primer

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用Origin 8.6進行數(shù)據(jù)分析與作圖，SPSS 17.0軟件對各指標進行獨立樣本T檢驗和相關(guān)性分析檢驗不同處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同利用方式對氨氧化微生物豐度和硝化潛勢的影響

自然放牧狀態(tài)下，AOA-amoA基因拷貝數(shù)為每克干土3.4×108個，AOB-amoA基因拷貝數(shù)為每克干土1.17×106個，AOA豐度顯著高于AOB的豐度(圖1)。與自然放牧相比，圍封后AOA豐度顯著下降(P<0.01)，下降了46.5%，而AOB豐度沒有顯著變化(P>0.05)，圍封后AOA豐度仍高于AOB豐度。與自然放牧相比，長期圍封顯著降低土壤的硝化潛勢(P<0.05，圖2)。

圖1 不同利用方式對AOA和AOB豐度的影響Fig.1 Effects of land use pattern changes on abundance of AOA and AOB注：圖中誤差線表示標準誤差，不同小寫字母代表放牧與圍封處理間差異顯著(P<0.05)。下同Note:The error bar in the figure represents standard errors,and different lower-case letters represent significant differences between graze and exclosure treatments (P<0.05). The same as below

圖2 不同利用方式對硝化潛勢的影響Fig.2 Effects of land use pattern changes on potential nitrification rate

2.2 硝化潛勢與AOA和AOB豐度的關(guān)系

3 討論

本研究結(jié)果顯示內(nèi)蒙古羊草草原長期圍封后，土壤硝化潛勢和AOA豐度顯著下降，AOB豐度則無顯著變化(圖1，圖2)；硝化潛勢與AOA豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與AOB豐度沒有顯著性相關(guān)(圖3)，內(nèi)蒙古羊草草原AOA相較于AOB對草地利用方式改變的響應(yīng)更敏感，硝化作用可能由AOA主導。相似的研究結(jié)果也在內(nèi)蒙古典型草原發(fā)現(xiàn)，AOA隨著草地利用方式(放牧和割草)的改變而發(fā)生顯著變化，而AOB豐度在不同草地利用方式下都無顯著變化[17]。在法國Theix地區(qū)的半天然放牧草地的研究中也發(fā)現(xiàn)AOA對草地利用的改變更敏感，圍封休牧降低了AOA的豐度，反之，適當?shù)姆拍翉姸葧黾覣OA豐度，但是圍封和放牧均沒有對AOB產(chǎn)生顯著影響[18]。

土壤理化性質(zhì)是決定氨氧化微生物豐度對土地利用方式響應(yīng)的重要因素[19]。在本研究中，AOA可能是決定硝化潛勢的優(yōu)勢種群，可能的原因是：1)土壤pH。前人通過分子生態(tài)學穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)(DNA-SIP)，驗證了AOA在酸性土壤(pH=4.9～7.5)中更易生存[20-22]，AOB更喜在堿性土壤(pH=8.3～8.7)中生存[23-25]。本研究中，土壤偏中性(pH=7.35)，AOA與硝化潛勢呈顯著正相關(guān)，AOA對草原利用方式改變的響應(yīng)比AOB更敏感。相反，在土壤呈堿性(pH=8.12～8.27)的內(nèi)蒙古四子王旗荒漠草原和武川縣高原草原的研究表明，AOB豐度相較于AOA在長期圍封處理后更敏感，而對AOA影響不顯著[9,26]。2)土壤氮素。研究發(fā)現(xiàn)AOA更好的適應(yīng)低氮低肥力的環(huán)境中，AOB更傾向于在高氮高肥力的環(huán)境中生存[27-28]。對我國北方4類土壤中氨氧化微生物的活性及對氨氧化的貢獻研究發(fā)現(xiàn)，AOA普遍在氨氮含量較低的草原土壤中主導硝化作用，而AOB在氨氮含量較高的濕地土壤中主導硝化作用[28]。本試驗中，土壤全氮和氨氮含量較低(全氮含量為1.34 g·kg-1，氨氮含量為2.18 mg·kg-1)，可能成為AOA主導硝化作用的重要原因。3)土壤水分。研究發(fā)現(xiàn)在旱地生態(tài)系統(tǒng)中，水的可利用性在氨氧化過程中起著重要作用，AOA比AOB更容易在干旱環(huán)境中生長[17,26]。因此，在中性土壤、低肥力和低水分的土壤環(huán)境中，內(nèi)蒙古羊草草原AOA比AOB對土地利用類型變化更加敏感。土壤環(huán)境背景一定程度上決定了對硝化過程起主導作用的氨氧化微生物類型[26,28]，因此，草地不同利用方式與其他土壤環(huán)境因素的交互作用對內(nèi)蒙古羊草草原的氨氧化微生物的影響還有待更加深入的研究。

4 結(jié)論

內(nèi)蒙古羊草草原長期圍封后，AOA豐度顯著下降，AOB豐度則無顯著變化;土壤硝化潛勢與AOA豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與AOB豐度沒有顯著性相關(guān)。AOA豐度對于草地圍封的改變更敏感，可能是影響土壤硝化潛勢的優(yōu)勢種群。