小麥轉錄因子TaWRKY26的克隆及其在抗、感白粉病和近等基因系中的差異表達

孫依帆　牛歡　馮靜云　黃建國　張露露　張超群　范寶莉　劉曉穎　王振英

摘 ? ?要：WRKY轉錄因子家族在植物抗逆反應中發揮著重要的作用。本研究以抗白粉病小麥Brock為材料，從中克隆到一個WRKY基因，該基因全長1 485 bp，預測ORF長1 392 bp，編碼463個氨基酸，分子量為49.8 kDa。經NCBI/Blastx比對發現，該基因與粗山羊草中WRKY26基因（序列號XP_020151406）所編碼的轉錄因子同源性高達98%，故將其命名為TaWRKY26，并將擴增得到的序列全長上傳至GenBank進行登記，序列號為MK358190。利用實時熒光定量PCR技術，對白粉菌脅迫后TaWRKY26在不同抗性小麥品種（抗病小麥Brock，感病小麥京411，抗病近等基因系Brock/京4117）中不同時間（0，2，4，8，12，24，48，72，120，168 h）的表達量進行分析，結果發現，在受到白粉菌侵染后，3個品種小麥的TaWRKY26表達量除12和72 hpi外，各時間段均表現為抗病小麥Brock>近等基因系Brock/京4117>感病小麥京411，抗白粉病小麥近等基因系Brock/京4117（抗病）中TaWRKY26表達趨勢更偏向抗病親本Brock。綜合推測TaWRKY26在小麥對白粉菌侵染的應答反應過程中發揮了積極作用。

關鍵詞：TaWRKY26基因;小麥;白粉病;實時熒光定量PCR技術

中圖分類號： S512.1 ? ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.002

Cloning of Wheat TaWRKY26 Gene and Its Function Analysis in Powdery Mildew Resistance

SUN Yifan， NIU Huan， FENG Jingyun， HUANG Jianguo， ZHANG Lulu， ZHANG Chaoqun， FAN Baoli， LIU Xiaoying， WANG Zhenying

（College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： ?The WRKY family plays an important role in the stress tolerance mechanism of plants. In this experiment， a gene of WRKY was cloned from the powdery mildew disease resistant wheat Brock. The gene contained a 1 392 bp ORF， and 463 amino acids with a predicted molecular weight of 49.8 kDa. The NCBI/Blastx alignment showed that this gene had 98% homology to the transcription factor encoded by the WRKY26 gene（SEQ ID： XP_020151406） in Aegilops tauschii， so we named it TaWRKY26. The full length of the amplified sequence was uploaded to GenBank for registration， and the accession number was MK358190. The expression patterns of TaWRKY26 in different resistant wheat[disease resistant wheat Brock， susceptible wheat variety Jing411， and Near-isogenic Lines Brock/Jing 4117（NILs）] after infected by powdery mildew were studied through real-time fluorescent quantitative PCR， the expression quantity at different time （0， 2， 4， 8， 12， 24， 48， 72， 120， 168 h） was analyzed. After infected by powdery mildew， the expression quantity of TaWRKY26 at 0， 2， 4， 8， 24， 48， 120， 168 h were all shown as follows： Brock>NILs >Jing411，and the expressive trend in NILs was more closer to disease resistant wheat Brock， indicating that TaWRKY26 participated in the interaction of wheat and powdery mildew.

Key words： TaWRKY26 gene; wheat; powdery mildew; RT-qPCR

小麥作為當今世界重要糧食作物之一，保證其產量對社會經濟發展有著重要的意義。小麥產量容易受到各種病原體侵害的影響，其中，白粉病是危害最大的病害之一，白粉病流行會造成小麥減產30%[1]。

植物在長期進化過程中，形成了各種抵抗自然環境不利因素的抗性機制，主要分為分子模式觸發的免疫反應（Pattern-triggered immunity，PTI）和效應子觸發的免疫反應（effector-triggered immunity，ETI）[2-3]。植物受到病原菌侵染時會誘發PTI反應，使植物發生一系列的變化，如Ca2+外流、激活下游信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated proteinkinase，MAPK）級聯反應等[4-5]。

在植物MAPK級聯反應中有一類植物所特有的轉錄因子——WRKY家族[6-7]。WRKY家族已在很多的植物、農作物中被分離鑒定出來，對其功能進行研究后發現WRKY基因在植物的生長發育和抗逆境脅迫過程中均發揮著重要的作用。樟樹中發現的WRKY基因參與單萜類化合物芳樟醇的合成[8];在栗和狗尾巴草中發現WRKY基因對非生物脅迫和激素信號有較強的響應[9];香蕉中MaWRKY26基因參與香蕉對冷脅迫的響應[10];棉花WRKY 基因對鹽、甘露醇和ABA脅迫均有響應[11]。WRKY家族不僅在抗非生物脅迫中起到重要作用，在植物抗病原菌的過程中，也起到了至關重要的作用。擬南芥中的AtWRKY33通過直接抑制ABA的表達水平來提高對灰霉病菌的抵抗作用[12];葡萄中的VvWRKY1過表達能夠顯著地提高對霜霉病的抗性[13];煙草中的WRKY基因沉默后植株對灰霉病的易感性增加[14]。

王振英教授實驗室對白粉菌脅迫栽培小麥Brock的早期應答基因轉錄組進行了分析，發現多個抗病通路的基因出現表達差異，其中包括MAPK級聯反應中的基因片段F5;通過Blastx比對發現F5與粗山羊草中WRKY26基因（序列號XP_020151406）所編碼的轉錄因子的同源性高達98%，與普通小麥中的TaWRKY2同源性也高達95%（序列號ACD80357）。目前，對植物WRKY26和TaWRKY2基因的研究多集中在植物抗逆和生長發育方面，尚未見到關于小麥WRKY26基因在抗白粉病方面的研究報道。

本課題組為了分析F5基因與抗白粉病的相關性，根據相關序列設計引物對其全長進行了克隆，并通過實時熒光定量PCR技術對不同抗性小麥在受白粉菌脅迫的條件下該基因的表達模式進行分析，希望能夠闡述WRKY26基因的功能，為其在小麥分子育種中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

白粉病抗性品種小麥Brock，由中國農業大學楊作民教授惠贈。

白粉病感性品種小麥京411，由王振英教授實驗室保存。

白粉病抗性雜交品種近等位基因系Brock×京4117（Near-Isogenic Lines，NILs），是王振英教授實驗室早期以抗白粉病栽培小麥Brock為抗病基因供體，以感病品種京411為輪回親本，通過雜交獲得F1，然后再以京411進行連續回交，每一代都在白粉菌選擇壓力下，選取抗病性狀明顯的單株，持續回交、選擇6代后，再自交一代獲得的抗病近等基因系。Brock×京4117在農藝性狀上偏輪回親本京411，抗白粉病性狀偏供體親本Brock。

小麥白粉菌15號生理小種，由中國農業科學院植物保護研究所提供，用于對小麥材料進行脅迫。

1.2 TaWRKY26基因克隆

利用Promega公司的EastepR ? ? ? Super Total RNA Extraction Kit提取Brock小麥的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop1000檢測RNA的質量以及濃度。然后以Oligo （d T）18為引物，利用Promega公司的M-MLV Reverse Transcriptase反轉錄成cDNA。根據Blastx比對結果設計WRKY基因引物（表1），進行PCR擴增。擴增體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP Mix 2 μL，WRKY-F 0.5 μL，WRKY-R 0.5 μL，cDNA1 μL，PrimeSTARR ? ? ? ?Max DNA Polymerase 0.5 μL，滅菌水15.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸2 min，反應進行35個循環;68 ℃終延伸7 min。將目標條帶進行切膠回收，加A尾，連接到pGEM-T easy Vector上。將重組載體轉化到大腸桿菌，進行藍白斑篩選，選取陽性克隆送公司測序。

1.3 序列分析

將測序結果提交 NCBI GenBank進行同源性分析。用APE軟件進行基因序列分析和拼接，同DNAMAN進行蛋白質序列比對分析并構建進化樹。

1.4 白粉菌脅迫下TaWRKY26表達模式分析

為了探究目標基因與小麥抗白粉病特性之間的關系，采用實時熒光定量PCR技術對白粉菌脅迫下小麥中的目標基因進行表達模式分析。在相同且適宜的條件下培養Brock、京411和NILs小麥，待材料第一片葉完全打開時，以抖拂法將白粉菌15號生理小種的分生孢子均勻的接種在小麥葉片上，接種0，2，4，8，12，24，48，72，120，168 h后，取相同部位的葉片，用1.2中所述方法提取葉片的總RNA并進行反轉錄，將所得cDNA用于表達模式分析。

根據所擴增TaWRKY26片段設計特異的實時熒光定量PCR引物qWRKY（表1），所擴增片段長127 bp，用Promega公司的EastepRqPCR Master Mix在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems上進行基因擴增、熒光信號檢測和溶解曲線分析（此步驟為儀器自動進行）。小麥Actin基因作為內參基因，引物序列詳見表1。所用程序為：50 ℃預變性2 min;95 ℃變性10 min;95 ℃變性15 s，58 ℃延伸30 s，反應進行40個循環。將所得數據用2-△△Ct法進行數據分析[15]。選用京411小麥0 h葉片中TaWRKY26表達量作為對照。

2 結果與分析

2.1 TaWRKY26基因的克隆

提取白粉菌侵染24 h的Brock葉片總RNA，反轉錄合成cDNA后用于基因擴增，擴增結果如圖1所示，在1 500 bp位置有一明顯條帶，將該條帶克隆、測序。測序結果（圖2）顯示，該片段長1 485 bp，與片段F5進行比對分析，發現包含F5片段;預測開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長1 392 bp，編碼463個氨基酸，分子量為49.8 kDa;通過氨基酸序列分析發現，該序列具有兩個WRKY基因的典型結構域：WRKYGQK結構。

2.2 多序列比對分析和進化樹構建

利用DNAMAN軟件對TaWRKY26與針茅（Stipa purpurea，Sp）、黍（Panicum hallii，Ph）、粗山羊草（Aegilops tauschii，At）和小麥（Triticum aestivum，Ta）中的WRKY轉錄因子家族其他基因進行多序列比對分析（圖3）發現，TaWRKY26與這些基因均具有較高同源性。進一步的系統進化樹分析（圖4）發現，TaWRKY26與粗山羊草中WRKY26基因親緣關系最近，與小麥中的TaWRKY2次之，這一比對結果與本實驗室前期工作中的Blastx比對結果一致，故將其命名為TaWRKY26，并將擴增得到的序列全長上傳至GenBank進行登記，序列號為MK358190。

2.3 白粉菌脅迫下TaWRKY26表達模式分析

為了驗證TaWRKY26是否參與小麥抗白粉病過程，利用實時熒光定量PCR技術，分別分析白粉菌侵染不同時間段TaWRKY26基因在不同抗性小麥中表達量趨勢變化。由圖5可知，在感病小麥京411中，白粉菌侵染后，TaWRKY26基因表達量呈升高-降低-升高-降低-升高的波動變化趨勢，至12 hpi 時達到高峰，為對照的4.2倍，至168 hpi與對照組（京411 0 hpi）接近;在抗病小麥Brock中，TaWRKY26基因表達量亦呈升高-降低-升高-降低-升高-降低-升高的波動變化趨勢，除12 hpi外，在其他各時間點均高于同時期感病小麥京411，通過多重比較發現，在0，24，72，120 hpi時表達量差異顯著（P<0.05），2，168 hpi時表達量差異極顯著（P<0.01），且在24 hpi表達量最高，為Brock葉片0 hpi時的2.9倍，對照組（京411 0 hpi）的13.2倍;在抗病小麥NILs中，受白粉菌侵染后，TaWRKY26表達量呈降低-升高-降低-升高-降低-升高-降低的波動變化趨勢，在24 hpi時表達量達到最高，為NILs葉片0 hpi時的2.0倍，對照組（京411 0 hpi）的5.6倍，NILs中TaWRKY26的表達變化介于感病小麥京411和抗病小麥Brock之間，但更趨向于抗病親本Brock。

3 結論與討論

植物在受到逆境脅迫時會發生一系列的抗逆反應，這些抗逆反應受多種轉錄因子的調控，同時一種轉錄因子能響應多種抗逆反應，即一因多效。WRKY轉錄因子最早是從甘薯中克隆出來的[16]。后來在多種植物中克隆到了WRKY轉錄因子家族并對其功能進行了研究，發現WRKY家族多參與植物抗逆、生物脅迫和衰老等過程。在小麥中，多個WRKY轉錄因子已被證實參與了小麥抗逆反應：吳華玲等[17]發現TaWRKY10、TaWRKY19-a、TaWRKY71和TaWRKY72-b可能是小麥抗逆調控網絡中重要的交流因子;還有研究發現，TaWRKY46能夠提高小麥植株的抗氧化能力[18];TaWRKY35過表達的小麥植株耐鹽性會顯著提高[19]。

在植物對白粉菌的響應中，WRKY基因也發揮著重要的作用，在大麥中沉默HvWRKY10、HvWRKY19和HvWRKY28后其對白粉菌的易感性顯著上升，而將這3個基因瞬時過表達后能夠正向調控大麥對白粉菌的響應[20];在擬南芥中發現的WRKY18和WRKY40會抑制植株對白粉病的響應[21];小麥中TaWRKY34在抗白粉病近等基因系中受白粉病菌誘導后表現出了上調趨勢，證明TaWRKY34可能參與了對白粉菌的防衛應答反應[22];MdWRKY40b長時間高量表達可能是導致富士蘋果易感白粉病的主要原因之一[23]。上述試驗都表明WRKY基因參與植物對白粉菌脅迫的響應。

目前，有關WRKY轉錄因子的研究均顯示WRKY26基因可能與植物抗逆密切相關。擬南芥中WRKY26基因能夠提高植株的耐熱性[24];葡萄中WRKY26基因可能應答多種植物逆境脅迫相關信號[25]等。本試驗克隆到的TaWRKY26具有兩個典型的WRKYGQK結構，經對比發現與粗山羊草中WRKY26基因同源性最高;從系統進化樹可以看出小麥中與TaWRKY26同源性最高的基因為TaWRKY2。TaWRKY2在植物中多參與抗逆應答反應，如將TaWRKY2過表達載體轉化擬南芥，轉基因植株的耐鹽性和耐旱性均顯著提高[26];將TaWRKY2轉入短柄草中，在室溫條件下能夠提高短柄草對赤霉病的抵抗性[27];在小麥中過表達TaWRKY2，小麥的耐旱性顯著提高[28]。說明小麥中的TaWRKY2基因參與植物耐鹽、耐干旱及對赤霉病的應答，TaWRKY26與粗山羊草中WRKY26基因和小麥TaWRKY2基因均有較高同源性，可推斷其可能在小麥-白粉菌互作過程中發揮重要功能。

前期工作中發現栽培小麥Brock中含有一個抗白粉病新基因，且由顯性單基因控制[29]，但Brock與我國大多數栽培小麥花期不遇，故利用Brock進行小麥抗白粉病育種工作進展緩慢，在Brock中開展抗病基因的相關研究對生產上合理利用該品種資源有重要意義。小麥抗白粉病近等基因系是進行小麥抗白粉病遺傳機制研究的寶貴材料，理論上，近等基因系與輪回親本遺傳背景相似，僅有一對抗病基因的差別，本研究通過對TaWRKY26表達模式進行分析后發現，其表達量在抗病小麥Brock中除12 hpi外均高于感病小麥京411，在抗白粉病小麥近等基因系Brock/京4117（抗病）中介于感病親本京411和抗病親本Brock之間，且更偏向抗病親本Brock，說明TaWRKY26受Brock中抗白粉病基因的正調控作用，可能參與小麥的抗白粉病應答反應，在小麥對白粉菌侵染的應答通路中起到一定的作用。

參考文獻：

[1]CONNER R L， KUZYK A D， SU H. Impact of powdery mildew on the yield of soft white spring wheat cultivars[J]. Canadian journal of plant science， 2003， 83（4）：725-728.

[2]BIGEARD J， COLCOMBET J， HIRT H. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity（PTI）[J]. Mol plant， 2015， 8： 521-539.

[3]COUTO D， ZIPFEL C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants[J]. Nat rev immun， 2016， 16： 537-552.

[4]嚴霞，牛曉磊，陶均.病原菌誘發的植物先天免疫研究進展[J].分子植物育種，2018，16（3）：821-831.

[5]CHEVAL C， ALDON D， GALAUD J P， et al. Calcium/

calmodulin-mediated regulation of plant immunity[J].Biochim biophys acta， 1833（7）： 1766-1771.

[6]Eulgem T， Rushton P J， Robatzek S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in plant science， 2000， 5（5）：199-206.

[7]余迪求，陳利鋼，張利平.轉錄調控因子WRKY超級家族：起源、結構和功能[J].植物分類與資源學報，2006，1（1）：73-81.

[8]陳彩慧，任艷芳，肖蓉，等.樟樹WRKY轉錄因子的克隆與表達分析[J].分子植物育種，2018，16（15）：4872-4879.

[9]MEHANATHAN M， BONTHALA V S， ROHIT K， et al. Global analysis of WRKY transcription factor superfamily in Setariai dentifies potential candidates involved in abiotic stress signaling[J]. Frontiers in plant science， 2015， 6：910.

[10]葉玉潔. MaWRKY26與MaVQ5蛋白互作調控MeJA誘導香蕉果實耐冷性的機制[D].廣州：華南農業大學， 2016.

[11]ZHOU L， WANG N N， GONG S Y， et al. Overexpression of a cotton （Gossypium hirsutum） WRKY gene， GhWRKY34， in Arabidopsis enhances salt-tolerance of the transgenic plants[J]. Plant physiology & biochemistry， 2015， 96：311-320.

[12]LIU S A， KRACHER B， ZIEGLER J， et al. Negative regulation of ABA signaling by WRKY33 is critical for Arabidopsis immunity towards Botrytis cinerea 2100[J].Elife， 2015， 4：e07295.

[13]CHLO? M， C?LINE L， KAPPEL C， et al. Over-Expression of VvWRKY1 in grapevines induces expression of jasmonic acid pathway-related genes and confers higher tolerance to the downy mildew[J]. Plos one， 2013， 8 （1）： e54185.

[14]HIROAKI ?A， ?NOBUAKI I， TAKAAKI N， et al. Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea[EB/OL].[2018-11-29].http：//www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15592324.2016.

1183085.

[15]KENNETH J L， THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.

[16]ISHIGURO S， NAKAMURA K. Characterization of a c DNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5' upstream regions of genes coding ?for sporamin and beta-amylase from sweet potato[J].Molecular and general genetics， 1994， 244（6）： 563-571.

[17]吳華玲，倪中福，姚穎垠，等.15個普通小麥WRKY基因的克隆與表達分析[J].自然科學進展，2008，18（4）：378-388.

[18]衛琳.小麥鹽、堿脅迫應答基因TaWRKY46和TaNRT1.2的功能研究[D].濟南：山東大學，2018.

[19]劉自成，苗麗麗，王景一，等.普通小麥轉錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析[J].中國農業科學， 2016， 49（12）：2245-2254.

[20]WISE R P . HvWRKY10， HvWRKY19， and HvWRKY28 regulate Mla-triggered immunity and basal defense to barley powdery mildew[J]. Mol plant microbe interact， 2012， 25（11）：1492-1505.

[21]PANDEY S P， Roccaro M， MORITZ S， et al. Transcriptional reprogramming regulated by WRKY18 and WRKY40 facilitates powdery mildew infection of Arabidopsis[J].The plant journal， 2010， 64（6）：12.

[22]秦偉，趙光耀，曲志才，等.小麥白粉病菌誘導的TaWRKY34基因的鑒定與分析[J].作物學報，2010，36（2）：249-255.

[23]羅昌國，袁啟鳳，裴曉紅， 等. 富士蘋果MdWRKY40b基因克隆及其對白粉病的抗性分析[J].西北植物學報， 2013， 33（12）：2382-2387.

[24]LI S J， FU Q T， CHEN L G， et al. Arabidopsis thaliana WRKY25， WRKY26， and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance[J]. Planta， 2011， 233（6）：1237-1252.

[25]于和平.葡萄WRKY26、WRKY27基因啟動子克隆及功能分析[D].大連：遼寧師范大學， 2013.

[26]NIU C， WEI W， ZHOU Q， et al. Wheat WRKY genes TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants[J]. Plant cell & environment， 2012， 35（6）：1156-1170.

[27]郭秀秀，王亮，蘇培森，等.利用短柄草進行TaWRKY2的抗赤霉病功能分析[J].山東農業大學學報：自然科學版，2017，48（4）：570-575.

[28]GAO H， WANG Y， XU P， et al. Overexpression of a WRKY transcription factor TaWRKY2 enhances drought stress tolerance in transgenic wheat[J]. Front plant sci，2018，9：997.

[29]WANG Z Y， ZHAO P， CHEN H， et al. Identification of RAPD markers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene， and their location on chromosome in wheat cultivar brock[J]. Plant production science， 2005， 8（5）：578-585.