三葉青地上部分多糖對乳腺癌小鼠的抗腫瘤作用

郭菁菁， 趙英杰， 李 偉， 錢朝東， 丁志山

（1. 紹興市中心醫院藥劑科， 浙江 紹興 312030； 2. 浙江中醫藥大學， 浙江 杭州 310051）

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg 是我國特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物， 主要分布于長江以南的江蘇、 浙江等地[1］， 作為民間常用中草藥， 擁有“藥王” “抗癌神草” 等美譽， 具有清熱解毒、 活血祛風等功效， 有著抗腫瘤、 解熱、 抗炎、 保肝、 抗病毒、 免疫調節等多種藥理作用[2］， 其中抗腫瘤活性的臨床應用最廣泛。目前， 已有報道三葉青提取物具有較好的抗腫瘤活性[3］，但鮮有相關成分的文獻， 主要集中在塊根中的黃酮類化合物， 地上部分較少關注， 對其藥效組分的研究更是寥寥無幾。 前期課題組發現， 三葉青地上部分多糖可能為其藥效活性組分； 本實驗建立小鼠乳腺癌荷瘤模型， 對該成分抗腫瘤藥效及其作用機制進行初步探討， 為進一步開發利用相關資源提供理論依據。

1 材料

1.1 藥材 三葉青地上部分采自浙江省杭州市富陽區受降鎮三葉青種植基地， 經浙江省藥品檢驗所專家鑒定為葡萄科三葉崖爬藤屬正宗紫藤三葉青品種 （浙食藥檢業《2015》 128 號）。

1.2 動物 BALB／c 雄性小鼠（SPF 級）， 體質量（22±2）g， 由中國科學院上海實驗動物中心供應， 動物生產許可證號SCXK （滬） 2013-0006。

1.3 細胞株 4T1 乳腺癌細胞株， 由浙江中醫藥大學生命科學院贈予。

1.4 試劑 胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司， 批號20160720）； RPMI 1640 培養基（杭州諾森德生物技術有限公 司， 批 號 ZI110516）； FITC anti-mouse CD4 （ 批 號100406）、 APC anti-mouse CD3 （批號100236）、 FITC Rat anti-Mouse CD4 （批號553046）、 PerCP anti-mouse CD8 （批號100734）、 PE Rat anti-Mouse FoxP3 （批號560408） （美國BD Biosciencens 公司）。

1.5 儀器 RE-52AA 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）； SHZ-DⅢ循環水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；LDZ5-2 低速自動平衡離心機 （美國安瑪西亞公司）；Alpha1-2LD plus 真空冷凍干燥器（北京博勱行儀器有限公司）； Series II Water Jacket CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）； Eclipse Ti-DH 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；BD Accuri 流式細胞分析儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 多糖制備 取一定量過60 目篩的藥材粉末， 稱定質量， 用雙蒸水按物料比1 ∶15 在80 ℃下回流提取3 次， 每次30 min， 合并3 次濾液， 減壓濃縮到一定體積， 然后加入3 倍量95%乙醇， 充分混勻， 靜置12 h， 3 500 r／min 離心10 min， 得到沉淀， 同法反復水提醇沉2 次， 收集沉淀，再用無水乙醇反復洗脫2 次， 抽濾， 揮去乙醇， 真空冷凍干燥， 即得。

2.2 模型建立 4T1 細胞復蘇后， 在5% CO2、 37 ℃下常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液中， 每2 ～3 d更換培養液并傳代， 收集培養至對數生長期的4T1 細胞，無菌生理鹽水清洗后稀釋至2.5×106／mL， 于每只BALB／c小鼠右側倒數第二個乳房處注射0.2 mL， 48 h 后觀察該處有約2 mm×2 mm 的粉紅色小突起， 表明造模成功。

2.3 分組及給藥 將“2.2” 項下成模小鼠隨機分為模型組、 環磷酰胺組及多糖低、 中、 高劑量組， 每組10 只， 另設空白組小鼠10 只。 空白組、 模型組小鼠每天灌胃給予10 mL／kg蒸餾水； 環磷酰胺組小鼠隔天腹腔注射40 mg／kg環磷酰胺無菌生理鹽水； 多糖低、 中、 高劑量組分別給予50、 150、 250 mg／kg 藥液， 各組連續給藥28 d。 小鼠末次給藥后取血， 脫頸椎處死， 分離胸腺、 脾臟、 肺臟、 肝臟、瘤塊組織， 計算平均瘤質量、 抑瘤率、 臟器指數， 觀察肺組織轉移灶。

2.4 外周血淋巴細胞分離 將小鼠血液收集于抗凝管中，加入3 mL 紅細胞裂解液， 充分混懸后靜置10 min， 待紅細胞完全破碎后4 ℃、 1 500 r／min 離心3 min， 棄上清， 去除紅細胞。 此時沉淀應為白色， 如有紅色， 則繼續加入裂解液， 重復上述離心操作， 然后用PBS 洗滌細胞1 次， 備用。

2.5 脾臟、 胸腺淋巴細胞分離 剖離小鼠脾臟、 胸腺組織， 剪刀剪成小塊， 加入事先準備好的培養基配置酶試劑中， 搖床孵育1 h， 加入完全培養基終止消化。 然后， 注射器平端研磨組織， 200 目篩網過濾， 收集單細胞， 培養液稀釋至密度1×106／mL 的細胞懸液。 然后， 加入紅細胞裂解液， 破紅15 min， 離心， 取上清， 組織細胞用PBS 緩沖液清洗， 4 ℃、 1 400 r／min 離心5 min， 去上清， 備用。

2.6 外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調節性T 淋巴細胞（Treg）檢測 將“2.4” 項下處理后外周血淋巴細胞用FACS 緩沖液清洗， 4 ℃、 1 400 r／min 離心5 min， 去上清。 然后， 加入FTIC-CD4、 APC-CD25 抗體各20 μL， 4 ℃下避光孵育15 min， FACS 清洗1 次， 加入破膜劑（Cytofix／Cytoperm），4 ℃下避光60 min， Perm buffer 清洗2 次。 再加入PE-Foxp3抗體， 4 ℃下避光孵育50 min， Perm buffer 清洗2 次，FACS 重懸細胞， 上流式細胞儀進行檢測。

2.7 脾臟、 胸腺CD4＋、 CD8＋T 淋巴細胞亞群檢測 將“2.5” 項下處理后的組織淋巴細胞加入APC-CD3、 FITCCD4、 PerCP／Cy5.5-CD8 抗 體， 4 ℃下 避 光 孵 育15 min，4 ℃、 1 000 r／min 離心5 min， 去上清。 然后， 加入500 μL PBS 重懸細胞， 上流式細胞儀進行檢測。

2.8 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理， 計量資料以s） 表示， 組間比較采用單因素方差分析； 計數資料以百分率表示， 組間比較采用卡方檢驗。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 多糖對小鼠腫瘤生長的影響 表1 顯示， 與模型組比較， 給藥組小鼠瘤質量、 瘤體積顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

表1 多糖對小鼠腫瘤生長的影響， n=10）

表1 多糖對小鼠腫瘤生長的影響， n=10）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

模型組 1.097±0.200 0.920±0.172 —環磷酰胺組 0.298±0.077△△ 0.215±0.081△△ 72.85多糖低劑量組 0.822±0.243△ 0.703±0.248△ 25.09多糖中劑量組 0.781±0.272△ 0.665±0.250△ 28.79多糖高劑量組 0.722±0.267△△ 0.595±0.197△△ 34.21

3.2 多糖對小鼠臟器指數的影響 表2 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠脾臟、 肝臟指數顯著升高， 胸腺指數顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）； 與模型組比較， 多糖組小鼠脾臟、 胸腺指數無明顯變化（P＞0.05）， 而肝臟指數顯著降低（P＜0.05）； 與環磷酰胺組比較， 多糖組小鼠胸腺指數顯著升高（P＜0.01）， 并且中、 高劑量組脾臟指數也顯著升高（P＜0.05）， 但各組肝臟指數無明顯變化（P＞0.05）。

表2 多糖對小鼠臟器指數的影響， n=10）

表2 多糖對小鼠臟器指數的影響， n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與環磷酰胺組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 脾臟指數／% 胸腺指數／% 肝臟指數／%空白組 0.46±0.11 0.21±0.03 4.23±0.45模型組 2.77±0.81?? 0.17±0.03? 4.81±0.46??環磷酰胺組 1.82±0.45△△ 0.09±0.03△△ 4.92±0.29多糖低劑量組 2.15±0.54 0.15±0.05## 4.40±0.43△多糖中劑量組 2.52±0.60# 0.16±0.04## 4.41±0.34△多糖高劑量組 2.40±0.70# 0.17±0.05## 4.39±0.31△

3.3 多糖對小鼠遠端肺轉移的影響 表3 顯示， 經過28 d生長后， 模型組小鼠腫瘤遠端肺轉移明顯， 而給藥組均能明顯抑制其發生； 與模型組比較， 多糖組小鼠肺轉移灶數顯著降低（P＜0.01）。

表3 多糖對小鼠遠端肺轉移的影響（±s， n=10）

表3 多糖對小鼠遠端肺轉移的影響（±s， n=10）

注：與模型組比較，△△P＜0.01

組別 （發生轉移荷瘤小鼠數／荷瘤小鼠總數）／只 肺轉移灶數模型組 10／10 2.30±0.21環磷酰胺組 2／10 0.20±0.13△△多糖低劑量組 4／10 0.67±0.33△△多糖中劑量組 5／10 0.70±0.26△△多糖高劑量組 3／10 0.40±0.22△△

3.4 多糖對小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例的影響 表4、 圖1 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠其比例顯著降低（P＜0.01）。

表4 多糖對小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例的影響， n=6）

表4 多糖對小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例的影響， n=6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。 出于成本考慮，僅選擇6 只小鼠進行實驗

空白組 0.57±0.06模型組 1.50±0.36??環磷酰胺組 1.67±0.42多糖低劑量組 0.87±0.32多糖中劑量組 0.53±0.06△△多糖高劑量組 0.60±0.1△△

3.5 多糖對小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響 表5顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細胞比例有降低趨勢， 但差異無統計學意義（P＞0.05）； 與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠兩者比例顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）。

圖1 多糖對小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例的影響

表5 多糖對小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響n=6）

表5 多糖對小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響n=6）

注：與模型組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01。 出于成本考慮，僅選擇6 只小鼠進行實驗

空白組 15.25±0.64 9.05±0.78 1.70±0.22模型組 11.65±0.64 7.05±1.06 1.66±0.16環磷酰胺組 11.10±0.71 8.50±0.14 1.31±0.06多糖低劑量組 14.30±0.42 10.45±2.62 1.41±0.31多糖中劑量組 19.90±2.83△△15.15±3.46△ 1.33±0.12多糖高劑量組 18.15±2.76△△14.10±5.09△ 1.34±0.29

3.6 多糖對小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響 表6、 圖2 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠脾臟CD4＋、CD8＋T 細胞比例顯著下降（P＜0.01）； 與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠前者比例顯著升高（P＜0.05）， 但后者比例無明顯變化（P＞0.05）， 同時CD4＋/CD8＋比例也顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

本實驗發現， 三葉青地上部分多糖可顯著抑制4T1 乳腺癌小鼠腫瘤生長， 在250 mg／kg 時抑瘤率達到了34.21%。 環磷酰胺作為臨床常用的抗腫瘤藥物， 其最主要不良反應是對機體的免疫抑制作用[4］， 而且對肝臟及骨髓也有一定損傷； 實驗結果顯示， 多糖與環磷酰胺相比在抑制腫瘤生長的同時還能顯著增加脾臟、 胸腺指數， 提示它對機體免疫器官具有保護作用。

表6 多糖對小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響s， n=6）

表6 多糖對小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響s， n=6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

空白組 28.40±2.29 8.57±0.15 3.32±0.33模型組 13.35±0.21?? 3.55±0.07?? 3.76±0.02環磷酰胺組 12.05±0.35 3.45±0.49 3.52±0.40多糖低劑量組 13.95±1.06 2.95±0.50 4.77±0.44多糖中劑量組 18.00±1.56△ 3.40±0.57 5.33±0.43△多糖高劑量組 18.70±2.12△ 3.55±0.21 5.26±0.28△

圖2 多糖對小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細胞比例的影響

T 淋巴細胞亞群是機體重要的抗腫瘤細胞免疫系統[5-6］， 它源于骨髓干細胞， 在胸腺分化成熟， 活化后可分為輔助T 細胞（Th）、 細胞毒性T 細胞（CTL）、 調節性T細胞（Treg）， 其中Th 均表達于CD4， 故也稱CD4＋T 細胞，根據其產生細胞因子及生物學功能的不同， 又分為Th1 和Th2 細胞， 前者主要分泌IFN-γ、 IL-2、 TNF 等， 介導細胞免疫， 輔助CTL 分化和增殖， 增強NK 細胞毒性， 從而起抗腫瘤作用， 而后者主要分泌IL-4、 IL-10、 IL-5、 IL-13等， 介導體液免疫， 輔助B 細胞， 從而抑制前者增殖[7］；CD8＋T 細胞屬于CTL， 具有細胞毒活性， 可直接殺傷腫瘤細胞， 在機體防御腫瘤免疫中起著重要作用， 但其本身不能特異性識別腫瘤抗原； 由于在CD8＋T 細胞攻擊腫瘤細胞和形成記憶細胞過程中， CD4＋T 細胞行使輔助功能， 故兩者在正常情況下保持動態平衡， 以維持機體細胞正常免疫功能[8］， 而癌癥患者大多表現為免疫功能紊亂， T 淋巴細胞亞群比例發生改變， 如CD4＋T 淋巴細胞水平、 CD4＋／CD8＋比值下降等[9］。

CD4＋CD25＋Treg 細胞為調節性T 細胞（Treg） 亞群，具有免疫抑制作用， 幫助腫瘤細胞參與免疫逃逸。 一方面，活化的CD4＋CD25＋Treg 細胞可通過抑制CD4＋、 CD8＋T 細胞的IL-2 基因轉錄和表達， 從而抑制T 細胞活化增殖[10］； 另一方面， 腫瘤組織通過CCL17、 CCL22 等趨化因子向腫瘤微環境招募該細胞。 另外， CD4＋CD25＋Treg 細胞可通過識別腫瘤抗原， 抑制機體抗腫瘤免疫應答， 使機體處于對腫瘤低應答或無應答狀態[11］， 同時它還能通過直接分泌或刺激DCs 分泌免疫抑制因子（IL-10、 TGF-β 等） 來達到免疫抑制作用。

結果顯示， 4T1 乳腺癌荷瘤小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細胞比例明顯升高， 脾臟組織CD4＋、 CD8＋T 細胞比例明顯降低； 三葉青地上部分多糖能明顯升高CD4＋T細胞比例及胸腺組織CD4＋、 CD8＋T 細胞比例， 降低外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 比例， 提高脾臟組織CD4＋／CD8＋比例。 由此可知， 該成分可通過增加CD4＋、 CD8＋T 細胞比例， 抑制Treg 細胞數量與功能， 從而破壞由Treg 細胞引起的免疫耐受， 提高機體抗腫瘤免疫應答， 發揮抗腫瘤活性。

綜上所述， 三葉青地上部分多糖可增強機體免疫功能，提高抗腫瘤免疫應答， 與該植物塊根有類似作用， 可為相關資源開發利用奠定基礎， 也能為開發新型中藥制劑提供理論基礎。 但目前僅對該成分與機體抗腫瘤免疫相關的T 淋巴細胞亞群進行研究， 今后可結合參與腫瘤免疫的關鍵細胞因子以更深入地探討其抗腫瘤免疫調控機制， 同時三葉青地上、地下部分多糖是否屬于同一物質也有待進一步考察。