癲癇清顆粒對海人藻酸致癲癇大鼠行為學變化及NF-κB 信號通路的影響

齊 越， 賈 冬， 李紀彤， 姜 鴻， 秦文艷， 韋 丹， 張冰冰， 康 凱，陳 賀?

（1. 遼寧中醫藥大學附屬二院， 遼寧 沈陽 110034； 2. 遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室， 遼寧 沈陽 110847； 3. 遼寧中醫藥大學附屬第三醫院， 遼寧 沈陽 110032）

近年來臨床研究及動物實驗均證實， 癲癇與炎癥的關系密不可分， 炎癥反應可降低癇性發作閾值， 增加神經元興奮性， 破壞血腦屏障， 介導神經元凋亡及突觸重塑[1-2］。另外， 核因子-κB （NF-κB） 廣泛分布于腦內多種細胞中，作為調節轉錄因子也與炎癥反應密切相關。

癲癇清顆粒為遼寧省中醫藥研究院的院內制劑， 前期研究顯示它可延長戊四唑及海人藻酸大鼠癲癇發作潛伏期，降低發作分級和持續時間， 增加腦組織白介素-4 （IL-4）水平， 抑制小膠質細胞及星形膠質細胞活化[3-8］。 本實驗以海馬內注射海人藻酸誘導癲癇大鼠模型， 考察癲癇清顆粒是否通過NF-κB 信號通路發揮抗炎作用， 進而對大鼠行為學產生影響， 從多方面多角度揭示該制劑抗癲癇作用機制，為臨床用藥提供必要的藥理學基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠60 只， 體質量（200±20） g， 由遼寧長生生物技術有限公司提供， 動物生產許可證號SCXK （遼） 2010-0001， 自由進食及飲水。

1.2 藥物 癲癇清顆粒（遼寧中醫藥大學附屬第二醫院，批號20140110， 5.31 g 生藥／kg）； 苯妥英鈉片（天津力生制藥股份有限公司， 批號1312027， 每片素片重0.1 g）。 海人藻酸（美國Sigma 公司， 批號MKBQ0 979 V， 含有量大于98%）； 水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司， 批號20100709）； NF-κB p65、 p-IκB、 IκB、 β-actin 試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 儀器 DW-5 腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）； Stronger90 牙 科 鉆 （韓 國 世 新 精 密 株 式 會 社）；Neofuge13R 高速冷凍離心機（上海力申科學儀器有限公司）； Mini-PROTEAN?Tetra Cell 垂直電泳系統（美國伯樂有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 60 只大鼠隨機分為假手術組、 模型組、苯妥英鈉組及癲癇清顆粒低、 中、 高劑量組， 每組10 只，分籠飼養， 自由攝食飲水。 根據前期實驗結果并結合文獻[10］， 設置癲癇清顆粒低、 中、 高劑量分別為4.74、9.47、 18.94 g／kg， 苯妥英鈉劑量為0.03 g／kg， 各組大鼠給藥量為20 mL／kg， 灌胃給藥， 每天1 次， 連續7 d， 假手術組、 模型組大鼠給予等體積蒸餾水。

2.2 模型建立 采用前期課題組報道方法[6］。 第7 天給藥結束后1 h， 350 mg／kg 水合氯醛麻醉大鼠， 將其固定于腦立體定位儀上， 頭部備皮， 碘伏消毒2 次， 于顱頂正中線作一3～4 cm 切口， 鈍性分離骨膜， 將囟門定位為零點，輕輕移動微量進樣器， 中線旁開2.20 mm、 后3.00 mm，制作標記點， 垂直使用牙科鉆， 輕鉆至穿破骨膜， 垂直進針約3.70 mm， 3 min 內緩慢勻速注入1.0 μL 海人藻酸（1 μg／μL）， 留針5 min， 假手術組大鼠注射等體積生理鹽水。 手術結束后， 縫合大鼠腦部肌肉及皮膚， 碘伏消毒2次， 整個手術過程注意保暖。

2.3 癲癇清顆粒對大鼠行為超興奮性的影響[9］

2.3.1 接近反應實驗 用筆垂直、 緩慢地從大鼠面前經過， 觀察其表現， 然后進行評分， 評分標準： ①無反應；②大鼠嗅此筆； ③大鼠離開此筆； ④大鼠凍結； ⑤大鼠跳離此筆； ⑥大鼠跳向此筆或是襲擊此筆。

2.3.2 響指反應實驗 在離大鼠頭部幾厘米處發出響指聲， 觀察其反應， 然后進行評分， 評分標準： ①無反應；②大鼠輕輕跳躍或退縮或突然搖耳朵； ③大鼠大跳。

2.4 大鼠海馬IκB／NF-κB 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。 末次給藥1 h 后， 每組隨機選取5 只大鼠， 迅速斷頭處死后冰盤上分離海馬， 稱定質量， 提取總蛋白， BSA法測定蛋白濃度， 10% 凝膠電泳， 轉膜， 5% 脫脂牛奶封閉， 一抗孵育， 4 ℃下靜置過夜， PBS 洗滌后加入二抗孵育， 再次洗滌后加入超敏ECL 化學發光試劑盒， 凝膠成像系統觀察相關蛋白的表達， Quantity One 4.6.2 圖像分析軟件進行分析。

2.5 統計學分析 通過SPSS 13.0 軟件進行處理， 數據用±s） 表示， 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠死亡情況 海人藻酸注射后， 模型組、 苯妥英鈉組及癲癇清顆粒低、 中、 高劑量組大鼠分別死亡3、 2、 3、2、 2 只。

3.2 癲癇清顆粒對大鼠行為學的影響 表1 顯示， 與假手術組比較， 模型組大鼠接近反應、 響指反應評分顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較， 癲癇清顆粒組兩者顯著降低（P＜0.01）。

表1 癲癇清顆粒對大鼠行為學的影響）

表1 癲癇清顆粒對大鼠行為學的影響）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 動物數／只劑量／（g·kg-1）接近反應評分響指反應評分假手術組 10 — 1.35±0.28 1.62±0.50模型組 7 — 2.16±0.41## 2.31±0.42##苯妥英鈉組 8 0.03 1.52±0.32?? 1.59±0.43癲癇清顆粒組 7 4.74 1.81±0.29?? 1.39±0.29??癲癇清顆粒組 8 9.47 1.54±0.31?? 1.52±0.22??癲癇清顆粒組 8 18.94 1.49±0.21?? 1.68±0.11??

3.3 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達的影響 圖1、 表2 顯示， 與假手術組比較， 模型組大鼠海馬組織p-IκB、 NF-κB P65 表達顯著增加（P＜0.01）， IκB 表達顯著減少（P＜0.05）； 與模型組比較， 癲癇清顆粒中劑量組僅IκB 表達顯著增加（P ＜0.01）， 而高劑量組p-IκB、NF-κB P65 表達顯著減少（P＜0.05， P＜0.01）， IκB 表達顯著增加（P＜0.01）。

4 討論

圖1 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達的影響

表2 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達的影響 ±s， n=5）

表2 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達的影響 ±s， n=5）

注：與假手術組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）p-IκB／β-actin IκB／β-actin NF-κB P65／β-actin假手術組 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 — 2.08±0.12??0.52±0.12? 1.92±0.12?苯妥英鈉組 0.03 1.41±0.21# 1.12±0.22# 1.26±0.21#癲癇清顆粒組 4.74 1.97±0.31 0.76±0.21 1.83±0.19癲癇清顆粒組 9.47 1.83±0.11 1.22±0.17## 1.53±0.11癲癇清顆粒組 18.94 1.23±0.18## 1.38±0.20## 1.17±0.153#?

大量研究表明， 癲癇是由于大腦神經元異常放電導致的腦電活動不平衡所致[10］， 而且常伴有一定程度的認知問題和適應障礙（如記憶困難、 注意力不集中、 睡眠不好、抑郁等）[11-12］。 2016 年一項研究表明， 高達50%的癲癇患者可能還具有異常行為， 如敵意、 沖動、 煩躁、 激動、 憤怒和攻擊行為等[13］， 推測其可能與腦內興奮和抑制的失衡有關。

目前， 在癲癇行為學研究的模型中藥物主要有匹魯卡品和海人藻酸， 動物大多為大、 小鼠， 可用評估實驗包括高架十字迷宮實驗、 明／暗實驗、 曠場測試、 強迫游泳測試、 行為超興奮性測試、 鼠尾懸停測試、 孔板測試、 MK-801 （地佐昔康） 誘導精神病樣行為等， 其中行為超興奮性測試中包括響指反應、 接近反應、 快速反應、 拾取反應。本實驗在大鼠腦內CA1 區注射海人藻酸， 并考察癲癇清顆粒對大鼠行為超興奮性的影響， 發現與假手術組比較， 模型組響指反應、 接近反應評分明顯增加， 表明大鼠腦內CA1 區注射1.0 μg 海人藻酸可較好地模擬癲癇動物模型行為學變化； 與模型組比較， 癲癇清顆粒組可明顯降低2 種評分， 表明它可較好地改善癲癇大鼠腦內興奮性、 抑制性的失衡關系。

炎癥與多種神經疾病密切相關， 如癲癇、 帕金森病、阿爾茨海默病、 中風等， 過去十年中炎癥在癲癇病因中的重要作用引起了眾多學者廣泛關注， 支持炎性過程在癲癇中發揮潛在作用的關鍵證據來源于（1） 人類耐藥性癲癇的治療中， 抗炎藥物可發揮一定抗癲癇作用； （2） 在手術切除難治性癲癇患者的腦組織中， 可見炎性幾種介質；（3） 癲癇發作可促使腦內免疫細胞或小膠質細胞的激活，導致炎癥細胞因子產生； （4） 自發性癲癇可導致永久性慢性炎癥， 故抑制炎癥因子表達可能對癲癇有治療作用。

核因子-κB （NF-κB） 作為調節的轉錄因子， 主要在腦內的神經元、 星形膠質細胞及小膠質細胞中存在， 并參與炎癥基因的表達、 細胞存活、 凋亡[14］， 當細胞處于靜息狀態時， 它與抑制性蛋白IκB 結合， 存在于細胞質內； 激活后， 其蛋白磷化后發生降解， 促使其進入細胞核內， 進一步激活靶基因， 調節炎癥因子表達， 如iNOS、 COX-2、TNF-α、 IL-4 等[15-16］。 研究表明， 在慢性癲癇患者致癇灶的腦組織病理切片中可見膠質細胞活化、 增生、 NF-κB 過表達[17］； 癲癇動物模型中也可見小膠質細胞NF-κB 信號通路激活， 并伴隨著炎癥因子含量的增加， 可知NF-κB 參與了癲癇發病過程中的炎癥信號通路的激活， 抑制其活化，可能成為干預癲癇發生發展的潛在治療靶點。 前期課題組研究表明， 癲癇清顆粒可抑制小膠質細胞及星形膠質細胞的活化[8］， 增加抗炎因子IL-4 表達[6］， 但具體作用機制尚不清楚； 本實驗考察了癲癇清顆粒對NF-κB 信號通路的影響， 發現它可面向減少p-IκB、 NF-κB P65 表達， 抑制IκB降解， 可能通過抑制NF-κB 信號通路、 調控炎癥因子表達來改善癲癇超興奮行為， 從而發揮抗癲癇作用。