石氏逐痰通絡補腎方對家兔膝骨性關節炎模型組織學變化的影響

吳軍豪， 沈祉培， 聞國偉， 陳 巍（上海市黃浦區中心醫院， 上海 200002）

膝骨性關節炎又稱增生性膝關節炎、 膝骨關節病等，是骨科常見病之一， 由滑膜關節以伴有關節周圍骨質增生為特點的軟骨喪失所致[1］， 臨床上以膝關節疼痛、 僵硬、活動受限等為特征， 可累及骨、 軟骨、 滑膜、 關節周圍支持結構。 隨著人口老齡化加劇， 該疾病發生率呈逐年上升趨勢， 傳統上認為其機理是一個不可避免的漸發展退變性過程， 而膝關節滑膜炎性病變又促進骨關節炎病程進展。

研究顯示[2］， 中醫藥對改善局部血液循環、 保護關節軟骨、 防止關節軟骨退變、 調節生物細胞因子促進軟骨生長均有較顯著的作用。 石氏逐痰通絡補腎方由上海市黃浦區中心醫院石氏傷科根據中醫理論結合臨床經驗配伍組方，臨床效果顯著， 故本實驗考察該方對家兔膝骨性關節炎模型關節軟骨組織學變化的影響。

1 材料與方法

1.1 研究設計 采用隨機平行對照方法， 在上海中醫藥大學附屬曙光醫院骨傷研究所進行實驗， 光鏡標本送往上海中醫藥大學光鏡實驗室讀片。

1.2 動物 雄性6 月齡新西蘭大白兔20 只， 體質量（2.3±0.4） kg， 由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.3 分組 家兔喂養3 d， 稱定質量后隨機分為正常組、模型組、 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組， 每組5 只。

1.4 試藥 逐痰通絡補腎方（由生黃芪15 g、 牛蒡子9 g、僵蠶9 g、 制川草烏9 g、 土牛膝12 g、 威靈仙12 g、 仙靈脾12 g、 川斷12 g、 澤漆9 g、 白芷9 g、 木瓜12 g、 乳香3 g、 沒藥3 g、 自然銅15 g、 豨薟草12 g 等藥材組成）； 扶他林緩釋片（瑞士諾華公司）。

1.5 造模 氯胺酮按0.1 g／kg 體質量的劑量肌注麻醉家兔后， Colombo 法建立膝骨關節炎模型[3］。

1.6 干預 術后第5 周起至第8 周結束， 逐痰通絡補腎方組家兔每天給予0.09 g／kg 相應藥物， 水煎濃縮后與飼料混合均勻， 制成定量顆粒飼料， 當天吃完； 扶他林緩釋片組家兔每天給予0.09 g／kg 相應藥物， 與飼料混合均勻， 制成定量顆粒飼料， 當天吃完， 以上給藥量相當于臨床等效劑量； 正常組、 模型組家兔未給藥。

1.7 標本采集 各組家兔于9 周后空氣栓塞處死， 打開右膝關節腔， 取下右膝關節標本， 在右股骨外髁取關節軟骨。

1.8 指標檢測

1.8.1 光鏡 標本用10%福爾馬林固定， 10%EDTA 脫鈣，石蠟包埋、 切片， 厚度為5 μm， HE、 番紅固綠染色， 每張切片選取5 個視野， 光鏡下觀察組織學變化情況， 并參照Colombo 的關節軟骨病理積分標準[3］進行統計積分。

1.8.2 透射電鏡 5% 戊二醛-4% 多聚甲醛固定， 10%EDTA 脫鈣， 漂洗， 1%鋨酸PBS 固定液固定， 乙醇逐級脫水， 環氧樹脂618 包埋， 切片， 枸櫞酸鉛電子染色， 透射電鏡下觀察膝關節軟骨細胞形態、 染色質、 細胞器、 膠原密度、 排列等。

1.9 統計學分析 通過SPSS 10.0 軟件進行處理， 數據以±s） 表示， 組間比較采用非參數檢驗。 P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體情況觀察 實驗過程中， 正常組家兔未見明顯異常； 第6 周， 模型組、 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔膝關節明顯腫脹， 部分有瘀紫， 關節活動度較差，不能正常行走； 第9 周， 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔大部分膝關節腫脹程度低于模型組， 關節活動度優于模型組。 取出關節軟骨進行觀察， 發現正常組家兔關節軟骨呈明亮藍白色， 表面較軟無裂紋； 模型組家兔關節軟骨發黃無光澤， 表面較硬， 關節表面有裂紋； 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔關節軟骨微黃無光澤， 表面較軟， 關節表面少量裂紋。

2.2 光鏡觀察 圖1 顯示， 正常組家兔軟骨表面光滑， 軟骨細胞散在、 均勻排列； 模型組家兔軟骨層厚度明顯變薄，軟骨表面碎裂、 剝脫， 軟骨層內排列稀疏、 不規則； 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔關節軟骨層厚度優于模型組， 軟骨表面光滑， 而且前一組軟骨層厚度更優， 排列也更致密整齊。

表1 顯示， 逐痰通絡補腎方組家兔關節軟骨病理變化總積分顯著低于模型組、 扶他林緩釋片組（P＜0.05）， 同時扶他林緩釋片組也顯著低于模型組（P＜0.05）； 逐痰通絡補腎方組家兔軟骨細胞病理改變（細胞成簇和細胞缺失）、 軟骨表層病理改變（表層缺損、 糜爛或潰瘍， 表面脆裂）、 軟骨深層病理改變（裂紋、 囊腫、 骨贅， 軟骨下骨暴露） 均顯著低于模型組、 扶他林緩釋片組組（P＜0.05）， 同時扶他林緩釋片組也顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖1 各組家兔膝骨性關節炎模型HE 染色（×100）

表1 各組家兔關節軟骨病理變化積分比較， n=25）

表1 各組家兔關節軟骨病理變化積分比較， n=25）

注：與模型組比較，?P＜0.05；與扶他林緩釋片組比較，#P＜0.05

軟骨細胞 0.85±1.00 6.55±0.95 3.15±1.08?# 4.05±0.82?軟骨表層 1.05±0.85 7.05±1.28 4.05±0.92?# 5.45±1.12?軟骨深層 1.15±0.82 10.50±0.72 5.40±1.22?# 8.05±1.05?總積分 3.05±1.52 24.10±1.40 12.60±1.55?# 17.55±1.40?

圖2 顯示， 正常組家兔透明軟骨層呈深紅色， 軟骨細胞散在、 均勻排列； 模型組家兔透明軟骨厚度明顯變薄，而且其中部分因纖維化顯示綠色； 逐痰通絡補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔透明軟骨厚度優于模型組， 綠色纖維化組織少， 而且前一組透明軟骨厚度更優， 纖維化程度也更低。

2.3 電鏡觀察 圖3 顯示， 正常組家兔軟骨細胞大小均勻， 細胞膜完整， 細胞結構清晰， 染色質分布均勻， 細胞周圍存在大量膠原纖維； 模型組家兔軟骨細胞大小不一，大量細胞膜被破壞， 細胞結構不完整， 細胞核出現固縮，表明細胞可能發生壞死或者凋亡， 同時細胞周圍膠原纖維減少、 排列不整； 逐痰通絡補腎方組家兔核膜、 細胞結構完整， 核內染色質分布均勻， 細胞周圍膠原纖維排列整齊；扶他林緩釋片組家兔軟骨細胞膜和細胞結構有所修復， 但不如逐痰通絡補腎方組明顯， 同時部分軟骨細胞核仁變性。

3 討論

最新流行病學調查[4］顯示， 60 歲以上人群中膝骨性關節炎患病率可達50%， 75 歲以上人群中則達80%， 軟骨退變與損壞與其發病密切相關[5］。 目前， 該疾病治療手段主要包括氨基硫酸鹽、 鎮痛劑、 非甾體類消炎藥（NSAID）、透明質酸衍生物、 皮質醇類關節腔內給藥， 關節鏡手術、關節置換等[6］， 但各自都存在缺陷， 臨床上尚缺乏特效方法。

圖2 各組家兔膝骨性關節炎模型番紅固綠染色（×100）

膝骨性關節炎屬中醫“骨痹” “痛痹” “寒痹” “鶴膝風” 范疇， 《張氏醫通》 曰： “膝為筋之府， ……膝痛無有不因肝腎虛者， 虛則風寒濕襲之”， 而且患者中以腎陽虛、瘀阻脈絡2 種癥候最多[7］。 近年來相關研究表明， 中醫藥可從關節軟骨細胞、 軟骨內膠原纖維、 軟骨滑膜等多個方面改善關節軟骨組織的病理變化[8］， 通過抑制細胞因子釋放來減輕軟骨炎癥反應和損傷[9］， 還能降低關節內氧自由基含有量， 防止軟骨基質降解[10］。

圖3 各組家兔膝骨性關節炎模型電鏡圖（×5 000）

石氏認為， “痰夾瘀血礙氣而病” 是膝骨性關節炎發病的主要原因， 一旦損傷必有氣機受阻， 氣機不暢必然影響到血的運行， 凝滯成瘀， 而血瘀又可使氣運失暢， 促成痰的形成[11］， 同時還指出“……損傷氣血自屬氣脈閉塞，脘竅凝滯之類， 易于痰聚為患”， 故痰的凝聚能影響氣機正常運行， 氣機阻滯， 運行不暢， 則血運失暢， 從而促成血瘀的形成， 反之損傷血瘀也能使氣機運行失常， 氣結則痰生內聚[11］， 因此石氏治療該疾病時以“痰瘀相關” 理論為指導， 通過逐痰通絡補腎方隨癥出入， 用于逐痰活血，通絡補腎， 改善循環， 抑制炎癥介質， 保護及修復關節軟骨。 石氏逐痰通絡補腎方中黃芪甘溫， 補氣兼能行滯通痹，助以川草烏宣通血脈、 散寒除濕； 牛蒡子辛寒滑利， 豁痰消腫， 白僵蠶消痰散結和氣血， 二藥合用宣滯破結， 能化筋絡頑痰獨邪， 助以澤漆行水化濕消腫； 佐以乳香、 沒藥通氣活血， 白芷、 白蒺藜祛風散寒， 木瓜、 桑枝、 土牛膝等諸藥祛風濕、 舒筋絡、 利關節、 強筋骨， 全方圍繞“痰” “瘀” 二邪， 兼顧氣血， 體現了石氏傷科的經典用藥思想——氣血行， 痰瘀祛， 而筋骨自健。

本實驗對家兔膝骨性關節炎模型進行組織學變化觀察，發現石氏逐痰通絡補腎方具有修復損傷軟骨層與透明軟骨、阻止軟骨纖維化、 保持及恢復軟骨細胞結構完整性等作用，而且效果優于扶他林緩釋片， 可為該方相關治療提供確切依據。