HPLC 法同時測定斑蝥中3 種核苷類成分

陳啟洪， 段燦燦， 李曉飛， 張建永?

（1. 遵義醫學院藥學院， 貴州 遵義 563009； 2. 遵義醫學院基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室， 貴州 遵義 563009； 3. 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義 563009）

斑蝥為節肢動物門昆蟲綱芫菁科昆蟲南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黃黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥體， 始載于 《神農本草經》， 其性辛、熱， 有大毒， 歸肝、 胃、 腎經， 具破血逐瘀、 散結消癥等功效， 用于癥瘕、 頑癬等頑疾[1-2］。 現代研究表明，斑蝥主要成分為斑蝥素類， 具有抗腫瘤和抗病毒的作用， 此外還含有蛋白質、 氨基酸、 脂肪及脂肪酸、 核苷類、 微量元素等[3-5］。 目前， 斑蝥的質量控制及藥理活性研究主要集中在斑蝥素上， 而對其中核苷類成分的報道較少， 其作為生物細胞維持生命活動的基本組成元素， 參與DNA 代謝過程， 具有抗腫瘤、 抗病毒、 基因治療等多種生物活性， 所具有較強活性使其成為熱點[6-9］。 貴州省作為斑蝥的重要產地， 具有豐富的資源，研究表明產于黔南布依族苗族自治州羅甸縣的南方大斑蝥和黃黑小斑蝥體內的結合斑蝥素對人肝癌HepG2 細胞增殖抑制作用明顯優于其他地區同種斑蝥， 是貴州優良地域種[10-11］。 因此， 本研究采用HPLC 法對斑蝥中核苷類成分進行檢測， 同時測定貴州省羅甸縣不同鄉鎮及來源斑蝥中該成分， 以期為該昆蟲多指標質量控制及核苷類成分合理開發應用提供依據。

1 材料

EClassical 3100 高效液相色譜儀（自動進樣器、 柱恒溫箱、 可變波長檢測器） （大連依利特公司）； BT125D 型電子天平（十萬分之一， 德國賽多利斯公司）； Aquelix 超純水處理器（美國Millipore 公司）； RE-2000A 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）； BCD-579WE 冰箱（青島海爾股份有限公司）； SG3300HE 超聲儀（上海冠特超聲儀器有限公司）。 尿 嘧 啶 （AB0542， 含 有 量＞98%）、 次 黃 嘌 呤（AB0366， 含有量＞98%） 對照品均購自成都埃法生物科技有限公司； 尿嘧啶核苷（PS16091802， 含有量＞98%） 對照品購自成都普斯生物科技有限公司。 甲醇、 冰醋酸為色譜純； 無水乙醇為分析純。

斑蝥均采自貴州， 經遵義醫學院李曉飛教授鑒定為芫菁科昆蟲南方大斑蝥（大斑芫菁， Mylabris phalerata Pallas）或黃黑小斑蝥（小斑芫菁， Mylabris cichorii Linnaeus） 的干燥體。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[12］Phenimenex Synergl 4 μm Polar-RP80A柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相1%冰醋酸（A） -甲醇（B）， 梯度洗脫， 程序見表1； 體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測波長254 nm； 檢測時間30 min； 進樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤各約5.0 mg， 精密稱定， 置于10 mL 量瓶中， 加純水溶解并定容， 即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱定昆蟲粉末約2.5 g， 加50 mL 75%乙醇回流提取2 次， 每次1.5 h， 合并2 次濾液，水浴揮干乙醇， 冷卻， 加水補足到100 mL， 放置水沉24 h， 抽濾除沉淀， 將樣品溶液減壓濃縮冷卻后加水定容至25 mL量瓶中， 搖勻， 過0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取純水， 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤對照品溶液， 供試品溶液適量， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。 結果， 在與尿嘧啶、 尿苷、 次黃嘌呤對照品色譜圖相應的保留時間處， 供試品溶液色譜圖中有三者吸收峰， 空白溶劑色譜圖中未顯示對應的色譜峰， 表明空白溶劑無干擾， 各峰分離度＞1.5， 色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液560、 480、 400、 320、 240、 160、 80、 4 μL 于2 mL 量瓶中， 加純水補足2 mL 稀釋至140、 120、 100、 80、 60、 40、20、 1 μg／mL， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，見表2， 可知尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 取同一對照品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次， 測得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤峰面積RSD 分別為0.13%、 0.56%、 0.38%， 表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一斑蝥（八總鄉黃黑小斑蝥） 6份， 按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤含有量RSD 分別為3.04%、 2.97%、 2.80%， 表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液（八總鄉黃黑小斑蝥）， 于室溫放置0、 2、 4、 8、 12、 24 h 后在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤峰面積RSD 分別為0.52%、 0.79%、 0.38%， 表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取同一核苷類成分含有量已知的斑蝥（八總鄉黃黑小斑蝥） 1.25 g， 精密加入對照品溶液，使其加入量分別相當于各對照品含有量的50%、 100%、150%， 按“2.2.2” 項下方法制備3 份供試品溶液（共9份）， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 計算回收率， 結果見表3。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=9）

2.4 樣品含有量測定 取羅甸不同鄉鎮和來源斑蝥， 按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 計算含有量， 結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果（mg／g）

3 討論

3.1 核苷類組分確認 目前斑蝥含有量測定主要集中在其脂溶性成分上， 如2015 版《中國藥典》 一部選擇斑蝥素，此外有學者建立了斑蝥脂肪油中棕櫚酸、 棕櫚油酸、 硬脂酸、 油酸、 亞油酸、 亞麻酸、 花生酸共7 種脂肪酸含有量的測定方法[13］， 可用于其脂溶性部位的質量控制。 在水溶性成分上， 有學者采用毛細管氣相色譜法建立了斑蝥中天冬氨酸、 谷氨酸、 絲氨酸、 組氨酸、 甘氨酸、 蘇氨酸、 脯氨酸、 丙氨酸、 纈氨酸、 蛋氨酸、 異亮氨酸、 亮氨酸、 精氨酸、 苯丙氨酸、 賴氨酸等15 種氨基酸含有量的測定方法[14］， 并用于斑蝥的炮制研究； 有學者采用原子吸收光譜法建立了斑蝥藥材中鐵、 錳、 銅、 鋅、 砷等微量元素的含有量測定方法等用于質量控制[15］； 然而關于核苷類成分的質量分析報道較少， 目前僅有一篇報道了斑蝥指紋圖譜，并發現了尿嘧啶核苷[16］。 為此， 本研究首先通過HPLC 分析， 探索腺嘌呤、 腺嘌呤核苷、 2′-脫氧腺苷、 雙脫氧腺苷、 鳥嘌呤、 鳥嘌呤核苷、 脫氧鳥苷、 黃嘌呤、 次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、 胞嘧啶、 胞嘧啶核苷、 胸腺嘧啶、 胸腺嘧啶核苷、 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 2′-脫氧尿苷、 蟲草素18 種中藥中常見的核苷類成分[7-9，17-19］在斑蝥中是否存在， 最終確認尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤。

3.2 樣品處理及色譜條件篩選 在供試品溶液制備方法研究中， 本實驗考察了超聲、 回流提取， 發現回流提取能得到更多核苷類成分。 然后， 考察了不同酸（磷酸、 甲酸、冰醋酸） 及其比例（0.5%、 1%、 2%） 對色譜峰分離的影響， 結果顯示1%冰醋酸具有較好的分離效果。

3.3 含有量測定 本實驗結果表明， 羅甸不同鄉鎮之間斑蝥各成分含有量差異較大， 表明即使是近產區質量也可能存在差異； 但同一鄉鎮的南方大斑蝥和黃黑小斑蝥之間差異較小， 提示產地對其質量影響可能較大。 在所測定的各核苷類成分中， 尿嘧啶含有量為0.16 ～0.71 mg／g， 尿嘧啶核苷含有量為0.71～1.21 mg／g， 次黃嘌呤含有量為0.47～1.07 mg／g， 其中尿嘧啶以沫陽鎮黃黑小斑蝥最高， 尿嘧啶核苷以八總鄉黃黑小斑蝥最高， 次黃嘌呤以紅水河鎮黃黑小斑蝥最高， 尿嘧啶差異最高可達4 倍。 在3 種核苷類成分總含有量方面， 紅水河鎮黃黑小斑蝥為2.44 mg／g， 整體優于其他鄉鎮和來源的樣品， 并接近藥典規定的斑蝥素（3.5 mg／g）[20］， 可能與后者抗腫瘤、 抗病毒功效有協同作用， 因此對其質量控制是有必要的。

綜上所述， 本實驗建立的HPLC 法能用于分析3 種核苷類成分， 其準確性、 重復性和穩定性良好， 適用于斑蝥中尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤含有量的測定， 對相關研究及多指標成分質量控制具有重要意義。