紫蘇二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因（PfDGAT1）鑒定及表達(dá)分析

周雅莉，任文燕，郝月茹，安 茜，段露露，李潤(rùn)植，王計(jì)平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.），唇形科紫蘇屬，為1年生草本植物[1]，是一種具有廣泛開(kāi)發(fā)利用前景的經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)衛(wèi)生部首批頒布的既是藥品又是食品的60 種“藥食同源”植物之一[2]，被廣泛用作中藥材和蔬菜、調(diào)味品等[3]。紫蘇種子中含油量可達(dá) 35%～64%，而 ω-3 脂肪酸（C18∶3）和 ω-6脂肪酸（C18∶2）含量分別高達(dá)54%～64%和14%，是目前所發(fā)現(xiàn)的C18∶3 脂肪酸含量最高的特殊油料作物之一[4-7]。

二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（Diacylgycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）合成的關(guān)鍵酶和限速酶，主要催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油[8]。對(duì)于大多數(shù)油料作物種子的TAG 合成積累具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，油料植物在其種子發(fā)育過(guò)程中，隨著DGAT 酶活性不斷加強(qiáng)油脂積累速度加快，而當(dāng)油脂含量趨于穩(wěn)定時(shí)，DGAT 活性會(huì)逐漸降低[9]。KUBIS 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在大豆（Glycine max）高油和低油品種中，大豆種子油脂積累速度、油脂含量均與DGAT 酶的活性呈正相關(guān)。HOBBS 等[11]首先在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到DGAT1 基因，且該基因的cDNA 在擬南芥中僅存在一個(gè)拷貝。隨后，人們相繼在油菜（Brassica napus）[12]、煙草（Nicotiana tabacum）[13]、大豆[14]、蓖麻 （Ricinus communis）[15]、旱金蓮（Tropaeolum majus）[16]和玉米（Zea mays）[17]等植物中克隆得到DGAT1 基因。

本研究依據(jù)紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從晉紫蘇1 號(hào)中克隆得到PfDGAT1 基因全長(zhǎng)序列，并分析該基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)特性，旨在為進(jìn)一步研究PfDGAT1 基因在紫蘇等油料作物油脂合成代謝過(guò)程中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫蘇品種晉紫蘇1 號(hào)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站。取不同組織器官及不同發(fā)育時(shí)期（開(kāi)花后 10，20，30，40 d）的種子，液氮速凍后 -80 ℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α 感受態(tài)與試驗(yàn)所用克隆載體pMD18-T 均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因克隆 利用EASYspin RNA 提取試劑盒（RN09，艾德萊生物）提取晉紫蘇1 號(hào)葉片總RNA，參考ABM 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit））方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA 用于后續(xù)試驗(yàn)。依據(jù)GeneBank 中紫蘇 PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA 的引物PfDGAT1-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。反應(yīng)體系為20μL：模板cDNA2μL，上下游引物各 0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Pfu DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O 12.9 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán) 30 次；72 ℃終延伸 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收并連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，鑒定陽(yáng)性克隆，送至通用生物公司（安徽）測(cè)序。

1.2.2 PfDGAT1 基因生物信息學(xué)分析 利用NCBIORF（Open Reading Frame，ORF）在線軟件對(duì) 1.2.1獲得的基因序列的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行識(shí)別，并將核酸、氨基酸進(jìn)行比對(duì)[18]。利用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)該蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用PSORTII（http:// psort.hgc.jp/form2.html）軟件對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；運(yùn)用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線軟件分析該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域，通過(guò)SOPMA（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_autom at.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用NCBI-CDD（http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；采用SWISSMODEL（http://swissmodel.expasy.org/）在線軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析與建模。運(yùn)用在線軟件PRALINE（http://www.ibi.vu.nl/programs/praline-www/）對(duì)紫蘇DGAT1 蛋白與其他已公布的植物蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)，從中找出保守域。運(yùn)用MEGA 7.0 多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇DGAT1 蛋白與其他多種高等植物氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 提取晉紫蘇1 號(hào)的根、莖、葉、花及不同發(fā)育時(shí)期（開(kāi)花后10，20，30，40 d）種子的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)紫蘇PfDGAT1 基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR 特異性引物PfDGAT1-q-F/R，以紫蘇18S rRNA（表1）作為內(nèi)參基因[19]設(shè)計(jì)引物18S rRNA-F/R，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 模板 0.5 μL，EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μL，正反引物各 0.3 μL，ddH2O 3.9 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，40 次循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算紫蘇PfDGAT1 基因的相對(duì)表達(dá)量[20]。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇PfDGAT1基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

以晉紫蘇1 號(hào)葉片cDNA 作為模板進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到1 條長(zhǎng)度約為1 964 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符。將編碼區(qū)序列與GeneBank 中紫蘇PfDGAT1 基因（AF298815.1）序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，推測(cè)的氨基酸序列與已公布PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）無(wú)差異，說(shuō)明分離獲得了正確的PfDGAT1 基因的 cDNA 克隆。

2.2 PfDGAT1基因的生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)克隆獲得PfDGAT1 基因序列全長(zhǎng)為1 964 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為 1 605 bp（核苷酸序列位于69～1 673），共編碼534 個(gè)氨基酸殘基（圖2）。通過(guò)ProtParam 軟件預(yù)測(cè)分析表明，PfDGAT1蛋白的分子式為C2812H4322N714O747S35，相對(duì)分子質(zhì)量為61.21 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為8.34，不穩(wěn)定系數(shù)為46.77，親水性系數(shù)為0.227，推導(dǎo)該蛋白質(zhì)為疏水性不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)PSORTII 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析顯示，紫蘇PfPDAT1 蛋白定位于質(zhì)膜的可信度為65.2%，預(yù)測(cè)其為膜錨定蛋白。

通過(guò)TMHMM 在線分析紫蘇PfDGAT1 蛋白跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示（圖3），PfDGAT1 蛋白有 9 個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，分別位于139～158，182～201，213～235，240～262，328～350，376～398，438～460，470～492，505～527 位氨基酸之間。通過(guò)NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，PfDGAT1 蛋白具有PLN02401（diacylglycerolo-acyltransferase）結(jié)構(gòu)域，屬于MBOAT超家族中的成員。

運(yùn)用SOPMA 在線軟件對(duì)紫蘇PfDGAT1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋（43.63%）和無(wú)規(guī)則卷曲（41.76%），β-轉(zhuǎn)角（2.81%）和延伸鏈（11.80%）則分散于整個(gè)結(jié)構(gòu)中。使用SWISS-MODEL 在線軟件對(duì)PfDGAT1 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析與建模，結(jié)果如圖4所示。

通過(guò)對(duì)紫蘇PfDGAT1 蛋白與其他植物DGAT1蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，紫蘇PfDGAT1 蛋白與其他植物蛋白一樣，具有9 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，分別是酰基輔酶A 結(jié)合位點(diǎn)、擬南芥突變體AS11 串聯(lián)重復(fù)序列、催化活性位點(diǎn)、磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)、蛋白激酶1 靶標(biāo)位點(diǎn)、硫?；钢虚g體結(jié)合位點(diǎn)、脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)簽、甘油二酯結(jié)合位點(diǎn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位保守域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示（圖5），紫蘇PfDGAT1 蛋白與芝麻、油橄欖的親緣關(guān)系較近，且序列同源性分別為89%，83%，與大豆和鷹嘴豆的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明DGAT1 蛋白在進(jìn)化上具有高度保守性。

2.3 紫蘇PfDGAT1基因表達(dá)特性分析

利用熒光定量PCR 技術(shù)分析紫蘇PfDGAT1 基因在晉紫蘇1 號(hào)根、莖、葉、花及不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)特性，結(jié)果表明（圖6），PfDGAT1 基因在紫蘇不同組織中均有表達(dá)，在種子中表達(dá)量最高，在莖和花中的表達(dá)量次之，在根中基本不表達(dá)，且隨種子發(fā)育該基因表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在開(kāi)花后20 d 達(dá)到最高。以根為對(duì)照，PfDGAT1 基因在莖、葉、花中的表達(dá)量分別是根中的 11.82 倍、1.77 倍和 8.57 倍，在開(kāi)花后 20 d 的種子中該基因的表達(dá)量是根中表達(dá)量的36.29 倍。

3 結(jié)論與討論

二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是TAG 合成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶，有研究表明，植物DGAT1 蛋白一般具有 9～10 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[13，21]。本研究使用含油量較高的紫蘇品種晉紫蘇1 號(hào)作為試驗(yàn)材料，克隆獲得PfDGAT1 基因后，分析該基因序列特征及編碼蛋白基本性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫蘇PfDGAT1 蛋白具有9 個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，這與前人研究結(jié)果一致[21]。多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PfDGAT1蛋白具有酰基輔酶A 結(jié)合位點(diǎn)、擬南芥突變體AS11 串聯(lián)重復(fù)序列、催化活性位點(diǎn)、磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)、蛋白激酶1 靶標(biāo)位點(diǎn)、硫?；钢虚g體結(jié)合位點(diǎn)、脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)簽、甘油二酯結(jié)合位點(diǎn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位保守域等9 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這與 HOBBS 等[11]，ZOU 等[22]，HE 等[23]，BOUVIER 等[13]，NYKIFORUK 等[24]對(duì)植物DGAT1 蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

MURPHY 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，DGAT 廣泛分布于植物的各個(gè)組織中，其活性在植物的花及發(fā)育的種子中最高。本試驗(yàn)利用熒光定量PCR 分析PfDGAT1基因在紫蘇不同組織器官中的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，PfDGAT1 基因在紫蘇不同組織中均有表達(dá)，其中，在種子中表達(dá)量最高，在莖和花中的表達(dá)量次之，在根中基本不表達(dá)，且隨種子發(fā)育，該基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。王計(jì)平等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在紫蘇種子發(fā)育過(guò)程中，其總脂肪酸含量逐漸升高，且PfDGAT1 基因表達(dá)量先升高后下降，與本研究結(jié)果基本一致，表明PfDGAT1 基因在紫蘇脂肪酸合成積累中發(fā)揮重要作用。

本研究克隆得到紫蘇PfDGAT1 基因cDNA，該序列全長(zhǎng) 1 964 bp，其中，CDS 為 1 605 bp，共編碼534 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)PfDGAT1 基因編碼定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有典型的DGAT1 功能結(jié)構(gòu)域，包含9 個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，PfDGAT1蛋白與芝麻、油橄欖的DGAT1 蛋白的親緣關(guān)系較近。qRT-PCR 結(jié)果表明，PfDGAT1基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子發(fā)育不同階段均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)量最高，PfDGAT1 基因表達(dá)量隨種子發(fā)育呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。