抗除草劑轉基因普通白菜的獲得和檢測

胡 毅，付 超，2，王雪婷，侯雷平，李梅蘭

（1.山西農業大學園藝學院，山西 太谷 030801；2.太原市小店區農業委員會，山西 太原 030032）

普通白菜（Brassica rapa ssp.chinensis Makino）原產于我國，是十字花科蕓薹屬中的一種重要蔬菜，營養豐富，在全國各地均有栽培。目前，通過組織培養進行遺傳轉化的體系已經日漸成熟，但是由于白菜攜帶不易再生的AA 基因型[1-2]，其轉化難度比較大，而且采用組織培養的方式進行遺傳轉化除了需要較長的試驗周期外[3]，通過組織培養得到的植株非常容易產生體細胞突變，并且其后代的育性大大下降[4]。而隨著植物穩定遺傳轉化技術日趨完善，近幾年興起的蘸花轉化具有操作簡單、轉化率高、重復性強等優勢，可以減少獲得純合后代的時間，并且大大縮短轉基因周期[5]。CLOUGH 等[6]率先利用蘸花法成功轉化了擬南芥，其轉化率為0.5%～3%。許紅梅等[7]研究結果表明，在花蕾期，采用5%的蔗糖、0.05%的Silwet L-77 表面活性劑可用于多種擬南芥的遺傳轉化。CURTIS 等[8]在對蘿卜的蘸花轉化研究中發現，添加適量濃度的表面活性劑Silwet L-77 可以提高轉化效率。付紹紅等[9]使用蘸花法成功的對油菜進行了轉化，轉化率可以達到0.69%。同時還發現，影響轉化效率的因素還包括蔗糖濃度以及菌株的種類等，當蔗糖濃度為10%且選用GV3101 菌株時，轉化效率最高。目前，該方法逐漸趨于成熟，已經在擬南芥、大豆[10]、亞麻[11]、黃瓜[12]、油菜[13]、菜心[14]、大白菜[15]、甘藍[16]、紫花苜蓿[17]等作物中轉化成功。但是對于普通白菜蘸花轉化的研究報道仍然鮮見。

本試驗通過對普通白菜蘸花轉化中蘸花時長、次數、蘸花間隔時間、蘸花后是否噴水等影響普通白菜蘸花轉化效率的多種因素的探究，得出一套普通白菜蘸花轉化的最優體系，為普通白菜采用蘸花法進行遺傳轉化建立一定基礎，使得大量獲得普通白菜轉基因植株更加便捷。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試普通白菜品種為冬性弱的75#品系，由山西省農業科學院蔬菜研究所惠贈。選取顆粒飽滿、大小均勻的普通白菜種子浸種催芽，2 d 后將其置于4 ℃冰箱低溫春化處理20 d。然后移栽至裝有基質（珍珠巖、松針土、熟土及泥炭的混合物）的營養缽中，待其現蕾抽薹后選取有少數花朵開放的蕾期植株作為供試材料。

1.1.2 農桿菌菌株和質粒 供試根癌農桿菌菌株為GV3101，該菌株含有攜帶有選擇標記Bar 基因和GUS 報告基因的載體。其中，整合了Bar 基因的植物將抗除草劑Basta。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液制備 用接種環蘸取菌液在加入慶大霉素（Gen，100 mg/L）和卡那霉素（Kan，50 mg/L）的LB 固體培養基上劃線培養，2 d 后挑出單個菌落轉移至 10 mL 液體 LB 培養基中，28 ℃，200 r/min 振蕩培養24 h 后，取75 μL 渾濁的菌液加入150 mL液體 LB 中，28 ℃，200 r/min 振蕩培養 24 h。調整菌液濃度至OD600＝0.8，離心15 min 收集菌體，重懸于 250 mL 含有 1/2 MS＋0.07%MES＋5%蔗糖＋0.05%Silwet L-77[18]的侵染液中備用。

1.2.2 蘸花 對處于花蕾期的普通白菜進行蘸花侵染，同時為確立高效的轉化系統，對普通白菜蘸花過程的影響因素：蘸花次數（相隔3 d 蘸2 次、相隔7 d 蘸2 次以及每相隔3 d 蘸3 次）、蘸花時間（1，2.5 min）和是否噴水（蘸花后隔日噴水和不噴水），共設計10 個處理，并將用蒸餾水蘸花處理的植株作為對照。蘸花處理之后，對其進行人工輔助授粉，并進行套袋隔離，待種子完全成熟之后進行采種。

1.2.3 Basta 抗性株篩選 將待篩選T1種子播于苗盤中，待子葉長出后，每3 d 噴施1 次0.002%的Basta 溶液，并及時去除黃化萎蔫的幼苗，噴施7～10 次后，篩選出仍能健康生長的植株，得到具有除草劑Basta 抗性的植株。

1.2.4 GUS 活性檢測 取普通白菜的真葉作為對照，對經過抗病篩選的植株葉片參照YONG 等[19]的方法進行GUS 染色檢測。

1.2.5 PCR 檢測 利用CATB 法提取篩選植株的DNA，采用體外擴增的方式對目的基因Bar 基因進行檢測，反應程序為：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共設置39 個循環。

2 結果與分析

2.1 蘸花結籽情況分析

對經過蘸花處理后的普通白菜進行結籽情況統計，結果列于表1。在蘸花時長方面，同等蘸花次數與蘸花間隔時長下，蘸花時間為1 min 時，所收獲的種子的數量與干質量都要優于蘸花時間為2.5 min時收獲的種子；在蘸花次數方面，同等條件下，共蘸2 次所收獲的種子干質量和數量都要優于共蘸3 次，此外進行3 次蘸花的植株甚至出現了部分花序萎蔫、壞死等情況，嚴重影響結籽量；在蘸花間隔時間方面，同等條件下，蘸花間隔時間為7 d 時，收獲的種子的干質量和數量都要優于蘸花間隔為3 d 時；在是否噴水方面，在蘸花次日不對花序進行噴水處理的植株出現了花序脫水、萎蔫、干癟等癥狀，噴水則可以有效的稀釋侵染液的濃度，并緩解相應的脫水癥狀，導致結籽數和干質量都要優于未經噴水處理的植株。因此，采用蘸花時間1 min，每隔3 d 蘸花1 次共蘸花2 次的組合與蘸花時間2.5 min，每隔7 d 蘸花1 次共蘸花2 次的組合，植株的結種情況較優。整體而言，較長的蘸花間隔時間（7 d）或者較短的蘸花持續時長（1 min）以及蘸花后第2 天對植株噴水處理會使結籽的數量和質量更優。

表1 各處理普通白菜蘸花結籽情況

2.2 T1抗性植株的篩選

成功轉化的植株將具有Basta 抗性，因此，用含有0.002%的Basta 溶液對T1幼苗進行篩選，結果發現，在T1幼苗中，只有第1 次試驗中采用蘸花2.5 min，7 d 后再次蘸花，且蘸花次日不噴水的組合獲得1 株具有Basta 抗性的幼苗。其他組合均未獲得。

2.3 T1抗性植株GUS染色試驗

成功轉化的植株因為攜帶有GUS 報告基因，所以，能被 GUS 染液染色[20]，取具有Basta 抗性的T1幼苗真葉進行GUS 染色試驗，結果如圖1所示。由圖1可知，只有4 號幼苗的真葉能夠被GUS 染色，其他幼苗均表現和對照組一致。表明4 號幼苗被成功轉化。

2.4 T1抗性植株的PCR鑒定

分別提取對照組和抗性植株DNA，體外擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，4 號植株與陽性對照在同一位置都有明顯條帶，大小約為370 bp，與Bar 基因的372 bp 一致，而其他植株沒有相應的條帶，這說明目的基因已經成功整合到普通白菜植株中。

2.5 T2植株GUS染色試驗

將確定已經成功整合目的基因的4 號幼苗移入土壤中栽培，待其抽薹結籽后收獲T2種子。隨機選取30 粒種子經春化處理后播種，待幼苗長出5～6 片真葉時，取幼苗真葉進行GUS 染色試驗，結果如圖3所示。由圖3可知，T2的幼苗1～7 號葉片均能被GUS 染液染色，而對照組無法被染色，表明T2得到的植株是純合的，而且其除草劑抗性得到了穩定遺傳。

2.6 T2植株幼苗的PCR鑒定

分別提取30 株T2植株DNA，體外擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。從圖4可以看出，在待測的8 個樣本中，有7 個樣本與陽性對照在同一位置都有明顯條帶，大小約為370 bp，與Bar 基因的372 bp 一致，而陰性對照在370 bp 處無明顯條帶，說明Bar 基因已經成功的整合并高效的遺傳給了下一代，但不排除由于多拷貝導致的T2植株PCR 擴增后呈陽性的比例較高，還有待于Southern 雜交驗證。

3 討論

不同的蘸花時間、次數以及間隔時長對不同植物遺傳轉化的效果不同[21]。在早期農桿菌真空滲透轉化擬南芥的方法中，CHUNG 等[22]研究發現，蘸花時間由5 s 變為5 min，其轉化效率大大提高，但蘸花時間過長會影響花序成活率。YANG 等[15]在大白菜中蘸花3 min，獲得轉基因植株。而本研究表明，較短的蘸花時間和較長的間隔時長雖然可以減輕侵染液對花蕾的負面作用，增加結籽量，但是無法獲得成功轉化的植株，只有當蘸花時間為2.5 min時，雖然結籽量有一定影響，卻可以得到有效轉化的植株，在農桿菌介導的遺傳轉化體系中對轉化率尤為重要，尤其是無限生長型花序的植株[23]。CLOUGH 等[7]研究發現，每隔5 d 對擬南芥進行一次蘸花處理，連續處理3 次，可以有效提高轉化效率，而大白菜每隔5～7 d 蘸花一次共蘸2 次，其轉化效率僅為0.1%，這可能是由于農桿菌很難通過蘸花處理進入白菜花器官[24]。本研究結果表明，只進行1 次蘸花處理，結籽的數量與質量要明顯優于2 次或多次蘸花處理，蘸花時間較短時，結籽的效果也更優。而蘸花2.5 min 并且蘸花2 次雖然植物結籽數受到較大影響，但只有這一種組合能獲得穩定遺傳的轉基因后代，因此，在使用蘸花法進行普通白菜遺傳轉化時，推薦使用這一組合的處理。

關于蘸花次日是否進行噴水處理影響結籽率與轉化成功率的方面，本研究認為因為侵染液中所含有的5%蔗糖會經由花序進入被植物吸收，高濃度的蔗糖溶液會影響植物細胞滲透壓，使得植物出現脫水、萎蔫等癥狀，大大影響結籽率，而且噴水可以稀釋蔗糖濃度，減少高濃度蔗糖對植物滲透壓的影響，此外噴水還可以稀釋農桿菌的濃度，減少農桿菌對植物的毒害作用，雖然可以提高結籽率，但是會使轉化效率大大降低，因此，在使用蘸花法進行普通白菜遺傳轉化時，不推薦進行噴水處理。

4 結論

本試驗通過對普通白菜蘸花法遺傳轉化的條件進行探索，最終得出了在使用蘸花法對普通白菜進行遺傳轉化時，使用蘸花2 次、每次間隔7 d、每次蘸花2.5 min 且蘸花后不噴水處理的組合，能夠獲得具有廣譜除草劑抗性且能穩定遺傳的轉基因普通白菜。本試驗將為普通白菜蘸花法遺傳轉化提供一定指導。