重組桿狀病毒AcMNPV-PK2-RFP誘導Sf9細胞凋亡的機制分析

衛麗麗，付月君

（山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

桿狀病毒是一種雙鏈環狀的DNA 病毒，基因組大小為80～180 kbp[1]。其可以作為生物殺蟲劑[2]，也可以作為真核表達系統[3]，還可以作為基因轉移載體[4]，因此，研究桿狀病毒侵染宿主細胞的機制對于其進一步應用具有重要意義。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autogrha californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是一種模式桿狀病毒，其基因組全長133 890 bp，包含154 個開放閱讀框[5-6]。Acpk2 基因位于AcMNPV 基因組的第123 個開放閱讀框，全長664 bp，編碼一個包含215 個氨基酸的多肽，與真核細胞的蛋白激酶同源性較高。Ac-PK2包含11 個基序，其中有6 個較為保守[7]。Western blot 分析結果顯示，PK2 蛋白在病毒感染早期和晚期均存在；Ac-PK2 在病毒侵染進程中發揮著重要的功能，可以在病毒侵染后營救蛋白質翻譯[8]。

桿狀病毒感染后，宿主細胞可誘導細胞凋亡作為一種防御反應。昆蟲缺乏B 細胞和T 細胞介導的適應性免疫系統，因此細胞凋亡的抗病毒防御對昆蟲尤為重要[9]。在多種脊椎動物、無脊椎動物和原生生物中，P53 家族蛋白被發現可以參與誘導細胞凋亡[10]。最近的研究從草地貪夜蛾和家蠶中克隆了p53同源物Sfp53 和Bmp52，并發現SfP53 蛋白可以觸發Sf9 細胞的凋亡并激活下游caspase 的活性[11]。HUANG 等[12]研究也發現，在AcMNPV 感染的 Sf9細胞中SfP53 蛋白水平顯著升高，但Sfp53 基因的轉錄并未升高。桿狀病毒有許多凋亡抑制因子（P35，IAP1s），可以抑制宿主細胞的凋亡、促進自身的復制[13]。有研究表明[14]，AfMNPV 侵染的 SL-1（Spodoptera litura）細胞中，伴隨宿主細胞凋亡，線粒體被破壞，細胞色素c 釋放到細胞質中。AfMNPV 感染也可誘導線粒體跨膜電位（DJm）降低[15]。此外，紫外照射也可使Sf9 細胞中細胞色素c 從線粒體釋放到胞質[16]。

本研究通過Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統構建了重組桿狀病毒AcMNPV-PK2-RFP，使PK2 蛋白與紅色熒光蛋白RFP 融合過表達。通過線粒體膜電位檢測和Western blot 的方法檢測了AcMNPV和 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細胞的進程中SfP53 蛋白表達和線粒體膜電位的變化情況，以及細胞色素c 的分布情況，旨在為進一步明確桿狀病毒的侵染加速宿主細胞凋亡的機制提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的草地貪夜蛾卵母細胞Sf9 細胞、AcMNPV 病毒和大腸桿菌DH10B 菌株均由山西大學生物技術研究所細胞分子生物學課題組保存，pFB-DRFP 由山西大學生物技術研究所細胞分子生物學課題組構建并保存。

1.2 主要試劑

限制性內切酶Sma I 和Xho I，以及T4 DNA 連接酶從寶生物（大連）技術有限公司購買，抗體SfP53 由生工生物工程（上海）股份有限公司制備，內參抗體anti-β-actin 和細胞色素c 的抗體anti-cytochrome c 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，熒光二抗（IRDyeR800CW Goat anti-Rabbit）購自美國Li-COR 公司，細胞裂解液購自碧云天生物技術公司，線粒體提取試劑盒和BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自索萊寶生物技術有限公司，Fu-GENE 6 轉染試劑購自美國Promega 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 的構建 首先，從病毒基因組擴增目的基因Ac-pk2，上下游引物分別為 Ac-pk2-F：ATACCCGGGATGAAACCCGAACA ATT；Ac-pk2-R：ATCCTCGAGCTAGTTTTTTAGAA CACGTTG，分別在上下游引物的5′端引入限制性內切酶Sma I 和Xho I 的識別序列。將其插入到中間載體pFB-D-RFP 構建重組中間載體pFB-D-PK2-RFP，并進行測序驗證構建成功。將構建成功的pFBD-PK2-RFP 轉化到DH10B 感受態細胞，使其與AcMNPV 的基因組Bacmid 發生Tn7 轉座，獲得重組Bacmid-PK2-RFP，通過M13 引物進行PCR 鑒定，以確定重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 構建成功。

1.3.2 重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 的構建 將重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 和FuGENE 6 轉染試劑按照1∶3 的比例混勻，加入到200 μL 的培養液中，靜置15 min。吸去6 孔培養板中的培養液，加入預混轉染試劑和桿粒的培養基，27 ℃孵育2 h，之后補入2 mL 的培養基。27 ℃培養箱培養3 d 后，用熒光顯微鏡觀察子代病毒的產生，有紅色熒光產生，即證明獲得重組病毒AcMNPV-PK2-RFP，之后取培養液的上清加入新培養的Sf9 細胞，可獲得2 代、3 代病毒。

1.3.3 線粒體的提取 用線粒體提取試劑盒進行分離提取，試劑盒包含4 種試劑。收集5×106個細胞，加入1 mL 試劑一和10 μL 試劑四，用研缽研磨。4 ℃600 g 離心5 min，棄沉淀，將上清轉移至另一離心管中，4 ℃11 000 g 離心10 min。離心完后上清即為胞漿提取物，可用于研究線粒體蛋白向胞漿的釋放；沉淀為完整的線粒體，含有完整的外膜和內膜，并具有線粒體的生理功能，可用于線粒體生理功能方面的研究。在沉淀中加入200 μL 試劑二和2 μL 的試劑四，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200 W，超聲 3 s，間隔 10 s，重復 30 次），用 BCA 試劑盒檢測線粒體蛋白濃度，之后進行Western blot分析。

1.3.4 線粒體膜電位檢測 細胞培養瓶中細胞長滿后棄去舊培養基，再加入5 mL 無血清昆蟲培養基，后吹打細胞使懸浮混勻，將懸液加到6 孔板中，每孔3×106個細胞，27 ℃培養箱過夜培養。用AcMNPV 或 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細胞 12，24，36，48，60，72 h，各處理組加病毒 1.5×107pfu/mL，即感染復數為5 MOI。采用羅丹明123（碧云天生物技術公司）染料檢測線粒體跨膜電位（MMP）。病毒侵染后的細胞，用終濃度為50 nmol/L 的羅丹明123染色30 min。之后用PBS 緩沖液洗滌2 次，在熒光顯微鏡下用488 nm 濾鏡觀察熒光強度。

1.3.5 Western blot 分析 用 5 MOI 的病毒（AcMNPV，AcMNPV-PK2-RFP）侵染 Sf9 細胞 12，24，36，48，60，72 h 后，收集細胞至 EP 管中，加入蛋白裂解液制備蛋白樣品，并測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠，對蛋白樣品進行電泳，之后切膠，將目的蛋白條帶電轉到PVDF 膜，封閉1 h 后，4 ℃過夜孵育一抗（Anti-P53 Antibady，Anti-Cytochrome C Antibady），第2 天用PBST 洗膜3 次；室溫避光孵育熒光二抗1 h，之后用PBST 清洗3 次，用奧德賽掃膜儀檢測目的條帶。

1.4 數據分析

每個試驗重復3 次，進行t 檢驗，分析數據的統計學意義，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 或P＜0.001 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 獲得重組病毒AcMNPV-PK2-RFP

首先構建了重組中間載體pFB-D-PK2-RFP。以重組質粒pFB-D-PK2-RFP 為模板，用Ac-pk2-F 和 rfp-R 引物進行 PCR 擴增，得到約 1 323 bp 的條帶，大小與所擴增的基因片段相一致（圖1-A）。將重組質粒pFB-D-PK2-RFP 用Xho I 和Sam I 酶切，重新得到645 bp 的片段（圖1-B），表明重組質粒構建成功，并進行了測序驗證。

將構建成功的pFB-D-PK2-RFP 轉化到DH10B感受態細胞，用M13 引物進行PCR 篩菌，菌落PCR可以從基因組擴增得到大小4 000～5 000 bp 的條帶，證明重組中間質粒上的目的片段成功地轉座到桿粒Bacmid，形成重組桿粒Bacmid-PK2-RFP，并通過PCR 的方法對其進行鑒定，結果如圖1-C 所示。將得到的重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 轉染Sf9細胞，獲得可以表達紅色熒光蛋白的重組病毒AcMNPV-PK2-RFP，其 1 代、2 代、3 代病毒在宿主細胞內表達的紅色熒光蛋白的熒光檢測如圖1-D所示。

2.2 AcMNPV-PK2-RFP侵染宿主細胞對凋亡因子SfP53蛋白表達的影響

通過Western blot 方法分析了AcMNPV-PK2-RFP 侵染宿主細胞對凋亡因子SfP53 蛋白表達的影響。由圖2-A 可知，野生型病毒處理組SfP53蛋白在12 h 就有表達，之后逐漸增加，60 h 后開始減弱。相較于野生型病毒處理組而言，AcMNPV-PK2-RFP 處理組Sfp53 蛋白的表達從12 h 開始逐漸增加?；叶葤呙杞Y果顯示（圖2-B），48，60，72 h 過表達PK2 的處理組中SfP53 蛋白的表達量分別大約是野生處理組的1.16 倍、1.39 倍、1.79 倍。有文獻報道，Sfp53 蛋白的表達影響細胞色素c 的釋放[17]，推測AcMNPV-PK2-RFP 通過影響Sfp53 蛋白的表達可能促進了細胞色素c 的提前釋放，加速了細胞的凋亡。接下來進一步檢測了線粒體膜電位和細胞色素c 的變化情況。

2.3 AcMNPV-PK2-RFP侵染對宿主細胞線粒體膜電位的影響

已知線粒體膜電位的變化是細胞凋亡進程中一個重要的事件，反映了線粒體滲透性的變化，試驗用羅丹明處理細胞后檢測了線粒體膜電位的變化，熒光顯微鏡的觀察結果如圖3-A 所示，反映的是 AcMNPV 和 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細胞的進程中線粒體膜電位的變化情況，結果表明，不論是野生型病毒處理組還是過表達PK2 的AcMNPV-PK2-RFP 處理組，在病毒侵染后綠色熒光都是逐漸增加，說明病毒侵染導致線粒體膜電位去極化，從而使膜受損、線粒體膜電位逐漸降低。統計結果顯示，相較于野生型處理組而言，重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 處理組在 24，48，72 h 綠色熒光的強度均顯著高于野生處理組（如圖3-B），說明重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 侵染細胞后可以加速線粒體膜電位的去極化、降低膜電位，從而促進細胞凋亡。

2.4 AcMNPV-PK2-RFP侵染對宿主細胞細胞色素c釋放的影響

細胞色素c 從線粒體中的釋放對細胞凋亡非常重要，而線粒體膜通透性決定細胞色素c 的釋放。通過Western blot 試驗研究了細胞色素c 在線粒體和細胞質的分布情況，結果表明，野生型病毒處理組中線粒體中的細胞色素c 減少得不是很明顯，細胞質中的細胞色素c 在病毒侵染后48 h 時仍然是微弱的條帶，細胞色素c 的釋放較慢（圖4）。相較于野生型病毒處理組，AcMNPV-PK2-RFP 處理組中宿主細胞線粒體中的細胞色素c 減少明顯，細胞質中的細胞色素c 從病毒侵染后12 h 開始逐漸增加。推測重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 處理組線粒體膜電位的降低進一步影響了細胞色素c 的釋放，從而影響了細胞凋亡。

3 結論與討論

線粒體作為細胞的能量供應站，對真核細胞的生存至關重要。在細胞凋亡過程中，線粒體不僅是蛋白質相互作用的場所，也是caspase 活化的場所。當線粒體膜通透性增加時，細胞色素c 釋放到細胞質中[18]。LIU 等[19]研究表明，AfMNPV 的侵染可以通過影響線粒體凋亡途徑誘導SL-1 細胞凋亡。關于家蠶細胞凋亡依賴細胞色素c 通路的研究表明，BmP53 的表達增加可能有助于細胞色素c 的釋放，但具體機制尚不清楚[20]。

本研究結果顯示，AcMNPV-PK2-RFP 侵染Sf9細胞 48，60，72 h 后，細胞 SfP53 蛋白的表達量均高于野生病毒處理組。推測SfP53 蛋白表達上調是AcMNPV-PK2-RFP 感染后期細胞色素c 釋放加速的一個因素。同時發現，AcMNPV 和AcMNPV-PK2-RFP 侵染Sf9 細胞后，可以通過影響線粒體凋亡途徑來加速宿主的凋亡。相對于AcMNPV 處理組，AcMNPV-PK2-RFP 處理組在感染后期提高了凋亡相關蛋白SfP53 的表達，降低了線粒體膜電位，加速細胞色素c 的釋放。之前的研究結果表明，過表達PK2 的重組病毒可以增加子代病毒的復制[21]，新產生的子代病毒會對宿主細胞進行2 次侵染，從而進一步刺激宿主細胞的凋亡通路。這些結果表明，線粒體凋亡途徑在AcMNPV 和AcMNPV-PK2-RFP誘導的細胞凋亡中發揮重要的功能，為揭示桿狀病毒侵染宿主細胞后加速宿主細胞凋亡的機制提供了試驗依據。