2種高效液相色譜法測(cè)定小米中黃色素的比較

王 喆，郝瑞麗，陳利青，馬芳芳，韓淵懷，3，張 彬，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801）

隨著人們生活品質(zhì)的提高，越來越多的人開始注重養(yǎng)生，由于雜糧具有保健功能[1-3]，人們對(duì)雜糧的需求量也越來越大，與此同時(shí)，對(duì)其品質(zhì)的要求也越來越高。谷子（Setaria italica）作為我國古老且種植面積最大的雜糧作物之一[4-5]，主要分布在干旱和半干旱地區(qū)[6]，其營養(yǎng)價(jià)值很高，含豐富的礦質(zhì)元素和維生素，它不僅供食用，還有藥用功能[7]。谷子脫殼之后稱為小米，有黃、白、綠等顏色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在眾多米色性狀中，黃米居多。有研究表明，米色是衡量小米品質(zhì)的重要指標(biāo)，小米米色越黃，米飯的口感越好[8-9]，而小米中的黃色素含量對(duì)其外觀品質(zhì)有很大的影響[10]，而且許多食品的著色劑中都有小米黃色素[11-12]。因此，挖掘一種測(cè)定黃色素更加高效、準(zhǔn)確的方法具有十分重要的意義。

目前，對(duì)于小米中黃色素的研究并不多[10]。王海棠等[13]通過從小米中提取黃色素，確定了其主要化學(xué)成分，并發(fā)現(xiàn)這些成分對(duì)光和酸較敏感，對(duì)氧化還原反應(yīng)和熱反應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性，但由于條件有限，并沒有準(zhǔn)確測(cè)出黃色素的組成成分[14-15]。賈鵬禹等[10]通過多種化學(xué)技術(shù)分析小米黃色素，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分與玉米黃色素基本相同，屬天然類胡蘿卜素。劉曉庚等[16]研究表明，類胡蘿卜素在深色谷物含量較多。李福乾等[17-22]的研究中詳細(xì)介紹了類胡蘿卜素的理化性質(zhì)及生理功能。李赫等[23]的研究中用C18 反相液相色譜分析法分離類胡蘿卜素類物質(zhì)，效果良好；惠伯棣等[24]通過采用C30 反相液相色譜法分析類胡蘿卜素類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該方法在異構(gòu)體分辨和分析專屬性方面比C18 更好。

近年來，隨著黃色素越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[25-27]，黃色素的相關(guān)研究也越來越多。研究測(cè)定黃色素的方法不僅可以為食品安全測(cè)定提供依據(jù)，且可以加快高品質(zhì)育種進(jìn)程[28-30]。如C18 柱對(duì)非極性類胡蘿卜素順/反異構(gòu)體的能力比C30 柱的分離差[24]，而C30 柱需要與適合的洗脫模式結(jié)合才能達(dá)到良好的分離效果。目前，關(guān)于測(cè)定黃色素及其組分含量的方法鮮見報(bào)道。

本研究以黃、白、綠3 種顏色的小米品種為試驗(yàn)材料，通過2 種高效液相色譜法分離出黃色素的主要成分，并測(cè)定各成分的含量，探究其含量對(duì)米色的影響，以期建立一種更加合理、高效的測(cè)定黃色素主要組分及含量的方法，為今后選育高葉黃素谷子品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為晉谷21 號(hào)（JG21）、支生谷（ZSG）和大青谷（DQG），其中，晉谷 21 號(hào)為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所通過對(duì)晉汾52號(hào)進(jìn)行60Coγ 射線輻射誘變選育而成，其品質(zhì)極好，不僅外觀看上去金燦燦的很誘人，蒸煮后還有飯香且口感好，因此，大家認(rèn)為其為頂級(jí)米質(zhì)，曾5 次獲全國農(nóng)博會(huì)優(yōu)質(zhì)谷米金獎(jiǎng)[31-32]。支生谷和大青谷為農(nóng)家品種，其小米米色呈白色和綠色。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 水飽和正丁醇、甲醇（色譜純）、MTBE（甲基叔丁基醚）、水（娃哈哈純凈水）、葉黃素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（均購自Sigma 公司）。

1.2 儀器

礱谷機(jī)；電子天平；HY-4 型調(diào)速多用振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；紫外可見光分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀。

1.3 高效液相色譜法一[33-34]

本試驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)[33-34]的方法進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，如樣品處理方法其采用的是先烹飪，而本試驗(yàn)采取的是直接研磨取樣，操作簡單；類胡蘿卜素提取方法不同，其采用甲醇提取該物質(zhì)，本試驗(yàn)則用水飽和正丁醇參照AACC 法提取；色譜柱不同等。

1.3.1 總類胡蘿卜素的提取 提取液制備：將純凈水和正丁醇按體積比1∶1 均勻混合，然后靜置分層，上層即為水飽和正丁醇。

各稱取2.0 g 研磨好的樣品，分別加入10 mL水飽和正丁醇，振蕩30 s，使其充分混勻，避光保存。在室溫下?lián)u3 h，4 000×g 離心10 min 后取上清，即為類胡蘿卜素提取液。通過分光光度計(jì)分別測(cè)3 個(gè)品種在450 nm 處的吸光值，從而得到總類胡蘿卜素含量。

1.3.2 樣品上機(jī)前處理 取適量類胡蘿卜素提取液，過0.22 μm 濾膜。前2 滴棄去，剩下的用于樣品高效液相色譜分析。

1.3.3 測(cè)定玉米黃質(zhì)和葉黃素含量的高效液相色譜（HPLC）分析

1.3.3.1 色譜條件 色譜儀：ACQUITY UPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)；色譜柱：Thermo Scientific Syncronis C18 超高效液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A 為MTBE∶甲醇∶水＝15∶81∶4（V/V/V），流動(dòng)相 B 為 MTBE∶甲醇＝90∶10（V/V）；流速：0.4 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長：448 nm。

1.3.3.2 洗脫條件 梯度洗脫：在0～3 min，流動(dòng)相B 的體積百分比為0；在3～4 min，流動(dòng)相B 的體積百分比由0 變到100%；在4～5 min，流動(dòng)相B 的體積百分比為100%；在5～5.3 min，流動(dòng)相B 的體積百分比由100%變到0。

1.4 高效液相色譜法二[35]

根據(jù)文獻(xiàn)[35]的方法進(jìn)行，但略有改進(jìn)，例如，樣品處理方法不同，其先清洗，然后冷凍干燥，并去殼3 次，研磨，而本試驗(yàn)直接去殼1 次，研磨，相對(duì)節(jié)約時(shí)間；其研磨完畢要篩細(xì)粉，本試驗(yàn)不需要。

1.4.1 總類胡蘿卜素的提取 各取適量谷子用礱谷機(jī)脫殼，把沒脫殼的、碎的小米和其他雜質(zhì)挑掉，將小米在咖啡機(jī)中研磨。分別稱取研磨充分的小米粉0.6 g 于10 mL 潔凈離心管中（外壁用錫箔紙包裹以避光），加入6 mL 水飽和正丁醇，快速振蕩使其充分混勻，用封口膜封住，放置在HY-4 型調(diào)速多用振蕩器上室溫振蕩3 h，后于4 ℃8 000 r/min條件下離心15 min，將其輕輕取出，收集上清，注意不要吸到沉淀。其中一部分用于高效液相色譜分析，另一部分用來測(cè)定總類胡蘿卜素含量。以水飽和正丁醇為參比，使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品在450 nm 波長下的吸光值，每個(gè)樣品做2 次重復(fù)，整個(gè)過程在避光條件下進(jìn)行。

其中，A 為波長 450 nm 處吸光值；V 為提取液體積（mL）；m 為樣品質(zhì)量（g）。

1.4.2 樣品上機(jī)前處理 從備好的類胡蘿卜素提取液中用新的注射器吸取0.5～1 mL 溶液，經(jīng)過濾器進(jìn)行過濾后，放到液相色譜專用瓶子中備用。

1.4.3 測(cè)定玉米黃質(zhì)和葉黃素含量的高效液相色譜（HPLC）分析

1.4.3.1 色譜條件 色譜儀：高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific，Ultimate 3000）；色譜柱：C30 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC 公司，Japan）；流動(dòng)相：流動(dòng)相 A 為MTBE∶甲醇∶水＝15∶81∶4（V/V/V），流動(dòng)相B 為MTBE∶甲醇＝ 90∶10（V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：450 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制 母液制備：用水飽和正丁醇將1 mg 玉米黃質(zhì)和葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶解（玉米黃質(zhì) 250 μL，葉黃素 200 μL），然后混勻，用錫箔紙包裹配置好的標(biāo)準(zhǔn)品母液，使其避光，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作液制備：用水飽和正丁醇將玉米黃質(zhì)和葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品按一定濃度梯度稀釋，玉米黃質(zhì)分別為 32，16，8，1.6，0.32，0.16，0.08 μg/mL；葉黃素分別為 44，22，11，2.2，0.44，0.22，0.11 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將水飽和正丁醇稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按濃度從小到大依次上機(jī)，從而獲取各樣品濃度對(duì)應(yīng)的色譜圖。根據(jù)峰面積定量，保留時(shí)間定性，以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（mAU/min）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，從而得到對(duì)應(yīng)的回歸方程。

1.4.3.3 洗脫條件 梯度洗脫：在0～20 min，流動(dòng)相B 的體積百分比由0 變到22.2%；在20～25 min，流動(dòng)相B 的體積百分比由22.2%變到0；在25～30 min，流動(dòng)相B 的體積百分比為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種高效液相色譜方法比較

從表1可以看出，方法2 的樣品用量和提取液用量均少于方法1 所用的量，從而節(jié)約了試驗(yàn)材料和試驗(yàn)試劑，也相對(duì)節(jié)約了操作時(shí)間。

表1 谷子葉黃素和玉米黃質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

2.2 葉黃素和玉米黃質(zhì)的回歸方程、線性范圍與檢測(cè)限

表2 葉黃素和玉米黃質(zhì)線性回歸方程

對(duì)玉米黃質(zhì)和葉黃素進(jìn)行了線性范圍考察，根據(jù)峰面積（Y）分別對(duì)其濃度（X）（μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，進(jìn)而說明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。由表2可知，不同方法的2 種物質(zhì)具有顯著的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。方法2 的檢測(cè)限與賈鵬宇等[10]的研究結(jié)果（0.3～0.4 μg/mL）相比較低，說明方法2 對(duì)葉黃素和玉米黃質(zhì)檢測(cè)的靈敏度更高。

2.3 樣品測(cè)試結(jié)果比較

2.3.1 2 種方法樣品分離情況 以晉谷21 號(hào)、支生谷、大青谷3 個(gè)品種作為試驗(yàn)材料，分別運(yùn)用方法1 和方法2 測(cè)定3 個(gè)品種的黃色素含量，進(jìn)一步比較驗(yàn)證了2 種高效液相色譜方法。

以JG21 為例，葉黃素和玉米黃質(zhì)的分離情況根據(jù)標(biāo)品保留時(shí)間定性。從圖1可以看出，2 種方法均可將這2 種物質(zhì)分離開。但是方法2 中葉黃素和玉米黃質(zhì)保留時(shí)間分別約在10，11 min，方法1的保留時(shí)間則約為23，25 min，可見方法二的靈敏度更高。另外，方法2 的定性結(jié)果與王海棠等[13]的定性研究結(jié)果較為一致，可見方法2 比較可靠。在2 號(hào)峰后面還有一些小峰，但由于條件有限，無法對(duì)其定性，需要采用核磁共振或液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步研究。

2.3.2 葉黃素和玉米黃質(zhì)含量比較 本試驗(yàn)測(cè)定了3 個(gè)小米品種中黃色素的主要組分含量，并對(duì)2 種測(cè)定方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。由表3可知，2 種方法均能滿足葉黃素和玉米黃質(zhì)的檢測(cè)，但檢測(cè)結(jié)果存在差異。方法2 檢測(cè)葉黃素和玉米黃質(zhì)的含量均高于方法1，說明方法2 較方法1 效果更好。

表3 2種方法測(cè)定不同谷子品種中葉黃素和玉米黃素的含量 mg/kg

從表3可以看出，各品種葉黃素含量均高于玉米黃質(zhì)含量。此外，2 種方法測(cè)出的JG21 的葉黃素和玉米黃質(zhì)含量均高于ZSG 的，而ZSG 的葉黃素和玉米黃質(zhì)含量又均高于DQG，該結(jié)果均與賈鵬禹等[10，14，35]的研究結(jié)果一致，說明方法 2 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性更可靠。因此，可以推測(cè)，小米中葉黃素、玉米黃質(zhì)含量均與黃色素含量呈正相關(guān)，即小米中葉黃素或玉米黃質(zhì)含量越多，黃色素含量越多，小米越黃，品質(zhì)越好。

3 結(jié)論與討論

本研究經(jīng)過2 種高效液相色譜法對(duì)3 個(gè)米色的小米品種中黃色素含量分析發(fā)現(xiàn)，2 種方法均能在30 min 內(nèi)完成葉黃素和玉米黃質(zhì)良好分離，C30柱可對(duì)2 個(gè)成分進(jìn)行更好的分離，這與EMENHISER 等[36]研究結(jié)果一致，證實(shí)了C30 柱具有分辨異構(gòu)體構(gòu)型的優(yōu)點(diǎn)。且方法2 的定性結(jié)果與王海棠等[13]的研究結(jié)果較為一致，可見方法2 比較可靠。此外，對(duì)于3 種小米中黃色素含量的高低，本研究與賈鵬禹等[10，14，35]的研究結(jié)果一致，再次證實(shí)黃色素確實(shí)對(duì)米色有影響，而且黃色素含量越多，小米越黃，小米品質(zhì)越好；但楊延兵等[4]對(duì)黃米和綠米的黃色素含量測(cè)定結(jié)果表明，綠米中的黃色素含量相對(duì)較多，這與本試驗(yàn)所得結(jié)果不一致，可能是由于試驗(yàn)材料的時(shí)期不同或試驗(yàn)方法不同導(dǎo)致，具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究中，葉黃素和玉米黃質(zhì)含量均與米色呈正相關(guān)。通過比較2 個(gè)方法發(fā)現(xiàn)，方法2 具有省材、省時(shí)，操作簡單，且重復(fù)性好，靈敏度高，結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此，可進(jìn)一步探究黃色素其他成分與米色的關(guān)系，并將其應(yīng)用在小米品質(zhì)改良中。