新疆土壤中解磷菌的分離純化與鑒定

劉思岑，亢秀萍，趙 宇，耿雪青，張 雄，王 磊

（1.山西農業大學園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西省設施園藝工程技術中心，山西 太谷 030801；3.山西省設施蔬菜提質增效協同創新中心，山西 太谷 030801；4.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240）

磷元素是植物所需的三大營養元素之一，磷元素參與植物許多代謝過程，包括細胞分裂、糖類物質代謝、脂類代謝、光合作用以及呼吸作用等過程，磷元素對維持植物的生長發育是必不可缺的。植物從土壤中吸收磷是植物獲取磷元素的主要途徑之一，然而盡管土壤中磷含量為0.05%（質量比），但其中僅0.1%的可溶性磷可以被植物吸收[1]，土壤中可被植物吸收利用的磷素遠達不到植物所需磷含量。目前，施用磷肥成為提高土壤有效磷含量的主要手段。然而，磷肥施于土壤后可用磷會快速被Ca2+（主要為堿性土壤），Al3+，Fe3+（酸性土壤）結合形成難溶沉淀，土壤中可溶磷含量很少超過30%[2]，經過徑流和滲出，只有10%～20%的磷元素可以被植物吸收利用[3]。不僅如此，大量的施用磷肥會使土壤肥力退化，尤其是耕作土壤。研究表明，大量施用化學肥料的同時，土壤中的砷、鎘、鉛等重金屬含量增加，更擾亂了微生物多樣性及其活性，從而導致農作物減產[4-5]。再者磷肥的制作主要從不可再生的磷礦石中分離，全球的磷礦石資源在50～100 a 將被耗盡[6]。而解磷菌是一類可以將難溶性磷轉化為能被植物吸收的有效磷的微生物，可以改善植物生長的磷素營養[7]，有效地促進植物的生長，提高農作物的產量[8-9]。

新疆地處東經 73°40′～96°18′，北緯 34°25′～48°10′，遠離海洋，深居內陸，四周有高山阻隔，海洋氣流不易到達，形成明顯的溫帶大陸性氣候。溫差較大，日照時間充足（年日照時數達2 500～3 500 h），年平均降水量為150 mm 左右，新疆多從內陸地區和國外進口菌種，但由于對本地環境的不適應，多數菌劑不能發揮效用。因此提取本地優良解磷菌種，創制以解磷微生物為主要成分的生物肥料，提高磷肥利用率，不僅可以促進農作物生長，而且可改善土壤環境。

本試驗從新疆本地土壤中分離出解磷菌，旨在為之后新疆土壤中解磷菌肥的開發和應用提供理論基礎，對促進新疆農業的可持續發展具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采自于新疆昌吉市室外土壤，取地面5 cm 下土壤，多點采集混勻，于4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 供試培養基 PVK 培養基：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，NaCl 0.1 g，MgSO40.1 g，KCl 0.2 g，酵母浸膏 0.5 g，（NH4）2SO40.5 g，MnSO40.002 g，FeSO40.002 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.0～7.2。NBRIP培養基：葡萄糖 10 g，Ca3（PO4）25 g，NaCl 0.2 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO40.1 g，酵母粉 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 6.8～7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌的分離與純化 稱取1 g 土壤，于研缽研碎置于含90 mL 無菌水的玻璃瓶內，搖床28 ℃，170 r/min 振蕩混勻 20 min，靜止 10 min，取溶液 1 μL于9 μL 無菌水的離心管內，設置濃度梯度為10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，分別取 1 mL 涂布于 PVK固體培養基，每個濃度重復3 次，3 d 后挑取周圍有透明溶磷圈的菌落，在LB 固體培養基上純化5 次。篩選菌株置于30%的甘油中，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 解磷能力定性定量的檢測

1.2.2.1 解磷能力定性檢測 將純化的菌株接種于NBRIP 固體培養基內，32 ℃下倒置培養7 d 后測定溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）及 D/d 的值，每個菌株3 次重復。選擇D/d 值較大的菌株進行液體搖瓶檢測。

1.2.2.2 解磷能力定量檢測 從1.3.1 篩選出來的菌株在NB 液體培養基中培養24 h（使其濃度為1×108cfu/mL），取0.5 mL 菌液于含50 mL Ca（3PO）42的NBRIP 液體培養基中，對照為滅菌的不加菌體的 NBRIP 液體培養基。32 ℃，170 r/min 條件下培養7 d，每24 h 取1 mL 三角瓶中培養液，超聲波震碎細胞后，10 000 r/min 條件下離心2 min，采用鉬藍比色法[10]測定有效磷含量，采用pH 計測定菌懸液pH 值。

1.2.3 菌株生理生化與16S rDNA 的鑒定

1.2.3.1 菌株生理生化的鑒定 將篩選出來的優勢菌株，進行革蘭氏染色、氧化酶試驗、接觸酶試驗、吲哚試驗及V-P、檸檬酸鹽、明膠液化、硫化氫、甲基紅等生理生化試驗。

1.2.3.2 16S rDNA 序列鑒定 將優勢菌株在LB 固體培養基上培養24 h 后，挑取菌落。以16S rDNA引物為細菌通用引物（27F:5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′和 1540R:5′-AGGAGGTGATCCAGCCG CA-3′）進行PCR 擴增，擴增產物經純化回收，交由上海生物工程有限公司進行測序，得到的序列在NCBI 上Blast 數據庫中進行比對。用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹，并對優勢菌株進行遺傳性質的分析。

1.2.4 不同初始pH 下解磷能力測定 配制NBRIP液體培養基，初始 pH 值分別設置為 5，6，7，8，9，在含50 mL NBRIP 液體培養基的玻璃瓶中加入0.5 mL的菌液，32 ℃，170 r/min 培養 5 d 后，取 1 mL 溶液在10 000 r/min，2 min 條件下離心，采用pH 計測定pH 值，用分光光度計測定溶液中的有效磷含量。

1.2.5 不同鹽濃度下解磷菌的解磷能力測定 配制鹽濃度為 0，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%的 NBRIP 液體培養基，按照0.5%的接種量注入培養基中，在32 ℃，170 r/min 搖床條件下培養5 d，取溶液1 mL進行離心，測定有效磷含量與pH 值。

1.2.6 不同溫度下解磷菌解磷能力測定 配制含磷酸鈣的NBRIP 液體培養基，接種0.5%的菌液，分別于 4，8，20，27，32，37 ℃下培養 5 d，取 1 mL 溶液于10 000 r/min，2 min 條件下離心，測定溶液有效磷含量與pH 值。

1.2.7 優勢菌株在不同磷源下解磷能力測定 將優勢菌株在LB 固體培養基中活化，振蕩培養24 h，設定菌懸液的OD600＝1，配制NBRIP 液體培養基，分別用等量的磷酸鋁、磷酸鐵、植酸鈣、卵磷脂替代NBRIP 中的磷酸鈣。振蕩培養5 d 后測定溶液中有效磷的含量和pH 值。

1.3 數據處理

應用SPSS 20.0 軟件對數據進行方差分析，并用Duncan 新復極差法比較不同處理間各種指標之間的差異；相關數據統計分析采用Excel 2007 軟件。

2 結果與分析

2.1 解磷菌定性檢測結果

分離純化出30 株有解磷能力的菌株，經平板初篩發現，6 株菌的 D/d 值在 1.6～2.0（表1），分別為 A12，A14，A16，B1，B5，C5，其中 D/d 值最大的為A14，A12，B5，C5。

表1 解磷菌在平板培養基上溶磷圈大小

2.2 菌株定量檢測結果

由表2可知，B5 的可溶性磷含量在第6 天時高達519.66 mg/L，此時pH 值為4.53，有效磷的產生伴隨著pH 值的降低。大量研究表明，解磷菌在產生有效磷時伴隨pH 值的降低，但有效磷的含量與pH 值呈負相關。營養液pH 值的減小可能是由于解磷菌在溶磷時會分泌有機酸，從而導致pH 值降低。

表2 解磷菌株7 d 內有效磷含量與pH 值

2.3 菌株B5的生理生化鑒定

由表3可知，該菌株為革蘭氏陰性菌株，其中，檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、接觸酶反應、吲哚試驗、產H2S 為陽性，甲基紅試驗、V-P 反應及氧化酶試驗為陰性。

表3 菌株B5 生理生化鑒定結果

2.4 菌株16S rDNA測序結果與分析

優勢菌株B5 經16S rDNA 測序，獲得1 495 bp的基因序列。將測序結果與在NCBI 中的Blast 核酸數據庫進行同源性對比，從而鑒定菌株，并用MEGA 6.0 軟件構建系統進化樹（bootstrap 值為 1 000），分析菌株的遺傳性質。對比結果顯示，菌株B5 與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）具有高度同源性，與熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌相似度為99%（圖1）。

2.5 解磷菌B5在不同初始pH值時溶磷量的變化

不同pH 值對菌株的解磷效果影響不同，經5 d搖瓶后測定錐形瓶中的有效磷含量如圖2所示，當菌株B5 在pH 值為5.0 時解磷效果較弱，在pH 值為6～9 時均可以產生較高的溶磷量，說明該菌在堿性土壤中的解磷效果較好，其中，pH 值為7 時溶液中的有效磷含量最高。

2.6 解磷菌在不同鹽濃度下溶磷量的變化

在相應條件下培養后，不同鹽濃度對解磷菌B5 溶磷量的影響如圖3所示。由圖3可知，鹽濃度為0.5%時，生長良好，有效磷含量最高；溶液的鹽濃度為3%時，溶液中的有效磷含量最低。

2.7 解磷菌在不同溫度下解磷含量的變化

菌株B5 在不同的溫度下釋放的有效磷含量也不同，當菌株處于27，32 ℃時，有效磷的含量分別為 352.28，342.75 mg/L；37 ℃時有效磷含量降低，表明假單胞菌在30 ℃左右時生長較好；菌株在4 ℃時解磷效果最差，有效磷含量僅為53.57 mg/L（圖4）。

2.8 解磷優勢菌株B5在不同磷源下有效磷含量與pH值的變化

振蕩培養5 d 后，有效磷的含量與pH 的變化如圖5所示。從圖5可以看出，以磷酸鈣為磷源時，有效磷含量最高，為523.45 mg/L；其次為植酸鈣，有效磷含量為108.96 mg/L；當磷源為磷酸鋁、卵磷脂、磷酸鐵時，有效磷含量較低，分別為26.00，24.85，6.38 mg/L。以有機磷的卵磷脂為磷源時，溶液的pH值達到8.05；而以無機磷為磷源時，溶液的pH 值不同程度減小。試驗結果表明，菌株B5 可以溶解有機磷，但相比無機磷效果較差。

3 結論與討論

新疆地處我國西北部，土地面積雖廣，但可耕種土地較少，且晝夜溫差較大，對于糧食、水果的種植、施肥等方式有待積極改善。本試驗以Ca3（PO4）2為唯一磷源從新疆土壤中分離純化出30 株解磷菌，篩選出1 株解磷效果最好的解磷菌B5，該菌溶磷量為519.66 mg/L，經16S rDNA 測序、生理生化試驗鑒定，該菌為假單胞菌屬細菌。任嘉紅等[11]曾從南方紅豆杉中分離出1 株熒光假單胞菌，該菌溶磷量為647.67 mg/L。

目前，研究解磷菌溶解無機磷的解磷機制主要為酸解機制，溶磷的發生往往伴隨pH 值的降低[12]。很多研究表明，pH 值與溶磷量并非正相關關系[13]，可能是由于解磷菌溶磷時分泌的有機酸或者產生H+使溶液 pH 值下降。ILLMER 等[14]研究發現，假單胞菌等菌溶解無機磷時不產生有機酸，但pH 值仍有降低，可能與菌株釋放的質子和NH4+的同化有關。除以上溶磷機制外，解磷菌的溶磷能力被證明與外源的磷源有關，ZENG 等[15]對假單胞菌的研究發現，在不同濃度可溶性磷含量的條件下，菌株分泌有機酸的含量不同。未來對菌劑的應用可以添加適量磷肥，以增加植物對磷素更好的吸收，從而促進植物生長。微生物礦化有機磷主要產生各種酶，如植酸酶、核酸酶、磷酸酶等[16]，溶解有機酸的酶主要為酸性磷酸酶與堿性磷酸酶。研究表明，解磷菌除了可以釋放土壤中的難溶性磷之外，自身可以產生促進植物生長的激素等物質，如IAA、赤霉素、鐵載體等[17-18]。有些解磷菌會與金屬離子反應，從而降低重金屬對土壤的毒性。