有機銅在動物生產中的研究進展

魯 陳，胡 賀，杜方超，劉發庭，邵 云，局文靜

（南京福潤德動物藥業有限公司，南京 210000）

銅是動物必需的微量元素，自從Braude等1945年發現銅對豬有促生長作用以來，一系列的試驗證明飼喂高出需要量的高銅日糧，可促進豬的生長，較為經濟有效的飼喂量是110～250 mg·kg-1[1-3]。目前高銅的來源主要是無機硫酸銅，因為其價格便宜。但是豬對其吸收率低，導致糞尿銅排泄多，對環境污染嚴重。基于此，國家農業部2009年對飼糧中銅含量進行了限量規定，限定銅的最高添加量斷奶仔豬銅為200 mg·kg-1，生長肥育豬為150 mg·kg-1，盡量降低殘留和對環境的污染。與此同時，低殘留的有機銅飼料添加劑先后被開發出來，如堿式氯化銅、氨基酸螯合銅、殼聚糖銅銅和酵母銅等，但是這些有機銅源生產成本高[4-7]。因此，研發既高效又經濟的飼用有機銅添加劑，對促進綠色飼料添加劑的發展具有重要的現實意義。研究發現，微生物能富集轉化無機銅為微生物有機銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡單和成本低等優點，因此，微生物有機銅如酵母銅，受到人們的青睞，不過，這類高銅菌的篩選主要是利用傳統的飼用微生物作為資源進行馴化，通過長時間銅誘導培養來獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩定性差，易退化，富銅能力也會隨之下降。為此，本研究綜述富銅土壤中能將無機銅轉化為微生物有機銅的高效菌株，為養豬生產中高效廉價的新型有機銅添加劑的使用提供借鑒。

1 微生物銅

1.1 微生物銅的概念

微生物富集吸收無機銅元素，通過微生物的生長代謝轉化無機銅為微生物銅，其是由對人或動物有利的益生菌發酵生產得到的制劑，其活性成分主要為微生物菌體。其飼喂效果主要表現促進機體的消化吸收，降低銅的排放、提升機體免疫能力及增進動物生長性能等[8]。

1.2 飼料銅添加劑的發展狀況以及存在的問題

銅元素是豬生長所必需的微量元素之一，是一種維持豬生長發育和生命活動的必需營養物質，是豬的健康和高效生產不可或缺的必需微量元素。為促進豬的生長發育，改善肉品質，提高豬對飼料的利用率，自20世紀90年代以來，銅元素被廣泛運用在養豬生產中。銅通過刺激促生長激素及相關因子（如胰島素樣生長因子-1）的合成與分泌，促進體蛋白質合成，促進豬的生長。在日糧中添加高銅，通過血-腦屏障在腦中積累，使腦銅含量增加，增加豬垂體生長激素mRNA（GH mRNA）濃度，增加血清中生長激素（GH）濃度，進而促進體內蛋白質沉積和骨骼生長[9]。硫酸銅100～300 mg·kg-1日糧飼喂仔豬，結果發現，隨著銅濃度增加組仔豬平均日增重（ADG）、料重比（F/G）、飼料攝入量和GH、胰島素（INS）、類胰島素一號增長因子（IGF-Ⅰ）、胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP-3）顯著增加（P＜0.01）；銅含量250 mg·kg-1時，仔豬ADG顯著增加（P＜0.01），從而促進斷奶仔豬的生長發育[5]。飼喂高銅日糧可增加豬的采食量，使平均日采食量提高9.91%，粗脂肪的表觀消化率提高10.01%，增加血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，提高淀粉酶的活性，提高豬免疫力[10]。使仔豬ADG提高23.24%，F/G 12.78%；提高Ca和P消化率[11]。給20～100 kg育肥豬飼喂高銅，ADG提高3.3%、料肉比降低1.5%，使背膘厚降低4.7%,眼肌面積提高17.0%[12]。妊娠期和哺乳期母豬飼喂高銅日糧也可使仔豬出生重提高8%，斷奶重提高5%[13]。然而在豬采食高銅過后，只有＜10%的銅被吸收利用并在機體中沉積，其余都隨著糞便排出體外，這些排出的銅又是不可降解的物質，并且還會對土壤和水體造成嚴重污染[14-18]。這樣，飼喂高銅飼糧不僅會對銅造成大量浪費，而且還會對地球上原有的生物鏈造成嚴重的破壞[19]。在農田中施放含高銅的豬糞有機肥會導致植物體內銅濃度的增加，不僅會導致農作物生長變慢、產量降低，還能影響農作物對其他營養元素吸收利用。植物在整個自然界的食物鏈中位于第一級營養水平，因此會通過食物鏈傳遞對整個自然界都會產生影響。當長期在牧草地中大量施用含有高銅的有機糞時，牧草中銅含量達到15～20 mg·kg-1時，綿羊采食過后就可能造成中毒，食物鏈源頭發生的變化在生物鏈的傳遞中具有生態放大作用[20]。豬糞有機肥中銅含量的增加會對植物生長產生不良影響，試驗發現，隨著有機肥中銅含量的增加，玉米葉片凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、光合色素含量顯著降低（P＜0.05）；玉米葉片可溶性蛋白質含量、游離氨基酸總量顯著降低（P＜0.05），玉米的生長性能和營養成分含量降低[21-22]。在養豬生產中使用微量元素銅不僅要考慮其帶來的經濟效益，同時還要考慮其可能會給環境帶來的污染[5]。

2 微量元素銅對動物機體影響

動物機體內銅主要分布于肝臟、腎臟、腦、心臟以及毛發中，其中肝臟不僅是銅重要的貯存庫，同時也是銅代謝的重要器官。銅在動物體內主要以與白蛋白結合的形式存在，在血漿中結合成血漿銅藍蛋白，紅細胞中結合成紅細胞銅藍蛋白，剩下的銅可以與蛋白質結合后形成肝臟銅蛋白、心肌銅蛋白等。銅對畜禽健康的影響見附表。

附表 銅對畜禽健康的影響

3 銅在機體內的消化吸收

動物消化道各段都能吸收銅，但最主要的吸收部位是胃、小腸和十二指腸。銅在被小腸上皮細胞吸收后，通過門靜脈轉運到肝臟，然后被肝細胞吸收并合成銅藍蛋白，而多余的未吸收的部分則排入膽汁，分泌后進入十二指腸。小腸上皮細胞對銅的吸收和轉運是動物完成銅生物利用的最關鍵的步驟，在轉運的過程中，銅的形態會產生變化。仔畜對日糧中銅的吸收率為15%～30%，成年動物為5%～10%[23]。當飼糧中添加的銅濃度低時，銅主要通過易化擴散的方式被吸收利用；當飼糧中銅濃度高時，可通過簡單擴散被吸收利用。在對銅絡合物的形態研究中發現，羧基、羥基、巰基等多種基團都能與銅發生絡合反應，具體的發生絡合反應的方式不僅與該基團在配體中的分布有關，還與配體的空間位阻、環境中的pH以及配體的濃度等因素有關[24]。采用銅離子選擇電極法測定pH 2～6時銅的電勢變化，結果發現當pH為2時，大部分銅都以離子態的形式存在，當pH升至3時，銅會與酒石酸、蘋果酸和檸檬酸產生絡合反應，pH 3.5時，與天冬氨酸會發生絡合；pH 4.1時與乳清蛋白也會發生反應；隨著pH上升，銅的電勢會迅速下降[25]。由此可推測銅在胃中主要以離子態存在，在腸道中主要以絡合物存在。

有機銅與無機銅（硫酸銅）在細胞中的透過率及細胞本身對銅的吸收率中也存在區別。利用細胞制成銅的吸收模型，通過分別對硫酸銅、賴氨酸螯合銅、谷氨酸螯合銅等不同形態銅的細胞透過試驗，發現螯合銅的細胞透過率遠高于硫酸銅。目前關于有機絡合銅和無機銅的生物利用率的差異存在兩種假說。一種是競爭吸收假說，認為絡（螯）合態微量元素的配體可對其中心的金屬離子形成一種保護，防止微量元素在到達吸收位點之前就被抗營養因子結合或者形成不溶性的物質；另一種則是完整吸收假說,認為氨基酸絡（螯）合礦物質是直接以肽或氨基酸的吸收機制被完整吸收。

4 不同類型銅添加劑在豬生產中的研究進展

4.1 飼料銅類型對豬生產性能的影響

目前飼料添加的無機銅主要為硫酸銅、納米銅等，有機銅主要有蛋白螯合銅、氨基酸螯合銅、堿式氯化銅、殼聚糖銅、螺旋藻銅和酵母銅等。大量試驗表明，將有機銅替代無機銅飼喂動物發現其對動物的生長沒有影響，且能降低糞便中銅的排放量，并能提高銅的生物利用率[26-27]。

銅添加劑的顆粒大小對豬生長也存在影響，日糧中添加納米銅50 mg·kg-1飼喂豬與硫酸銅飼喂豬相比，納米銅能改善豬的生產性能，提高銅的利用率，降低糞銅含量。

銅添加劑的類型對仔豬生長也存在影響，飼料中添加羥基氯化銅（150 mg·kg-1）能較硫酸銅顯著提高豬的ADG和末重，降低仔豬腹瀉率[28]。Guo等用0～160 mg·kg-1蛋白銅和堿式氯化銅（TBCC）飼喂仔豬發現，添加蛋白銅40或80 mg·kg-1能顯著增加豬的ADG，添加蛋白銅80 mg·kg-1與添加TBCC 160 mg·kg-1相比，糞銅排放量降低50%，且對豬的生產性能和健康無不良影響[4]。氨基酸螯合銅對仔豬的生長也具有積極作用，如在飼料中添加硫酸銅160 mg·kg-1和N-氨甲酰谷氨酸螯銅，N-氨甲酰谷氨酸螯銅能夠促進仔豬增長，提高F/G和降低糞銅排放量；蛋氨酸銅可提高仔豬ADG和飼料的利用率，提高F/G；甘氨酸銅增加仔豬ADFI、降低料肉比[29-31]。小肽螯合銅飼喂仔豬，也能顯著增加仔豬的ADG，降低糞銅排放[32]。殼聚糖銅100 mg·kg-1、硫酸銅100 mg·kg-1、殼聚糖銅100 mg·kg-1+硫酸銅飼料和無銅日糧飼喂仔豬，飼喂殼聚糖銅仔豬ADG高、腹瀉發病低；十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比均高于其他組；回腸上皮細胞凋亡顯著減少；抗氧化酶活性顯著高于其他組[5]。用富銅螺旋藻代替硫酸銅飼喂仔豬，結果也發現富銅螺旋藻能使低密度脂蛋白膽固醇降低17.05%（P＜0.05），總膽固醇下降9.43%（P＜0.05）[33]。

不同銅添加劑類型對生長肥育豬的影響不同。飼喂硫酸銅75 mg·kg-1和TBCC 150 mg·kg-1，結果發現整個試驗期飼喂硫酸銅和TBCC都能提高平均日采食量（ADFI）、降低了G/F；隨著銅添加量的添加，ADG、末重、ADFI和瘦肉率也顯著增加[34]。對飼喂硫酸銅4、160 mg·kg-1和蛋氨酸螯合銅20～160 mg·kg-1，發現飼喂蛋氨酸螯合銅80 mg·kg-1能顯著增加豬的ADG和飼料轉化率；與硫酸銅160 mg·kg-1組相比，豬的末重增加1.8 kg，胴體重增加2.3 kg[35]。小肽螯合銅代替硫酸銅飼喂肥育豬，對生產性能和健康狀況無不良影響，且能顯著降低糞銅的排放量[36]。從以上研究來看，各種形式的高銅都對豬的生長具有顯著影響，提高豬的生長性能，但有機銅的生物利用度要高于無機銅，不僅有效降低了豬糞中的銅含量，還可以節約礦物資源，降低環境污染。

4.2 飼料銅類型對豬免疫性能的影響

銅在維持豬免疫功能中起重要作用，其不足或過量攝入會損害豬的免疫細胞數量和功能[37]。試驗發現銅的促生長作與它的抗菌作用有關，而高銅的促生長作用也與其抗菌作用有關[38-39]。斷奶是仔豬生長的一個重要階段，斷奶后3～4 d是仔豬腹瀉的潛伏期，1周后可達到高峰，可能是通過食物狀態、營養成分、生理狀態或環境條件的改變，而引起腸道菌群的變化，使得消化道內菌群失調，腸道內pH升高，病原菌大量繁殖，從而導致仔豬下痢[40]。銅在胃腸道內可發揮著類抗生素的作用，如載銅氨基多糖納米微粒可顯著降低盲腸中總需氧菌、總厭氧菌、沙門氏菌和大腸桿菌等有害菌的數量，而顯著增加乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數量；殼聚糖銅能顯著降低腸道內大腸桿菌和沙門氏菌數量，促進乳酸桿菌的增殖[41]。缺銅可降低白細胞介素2水平和T細胞增殖[42]。

對斷奶仔豬飼喂不同劑量的載銅納米殼聚糖（CNP-Cu），結果發現仔豬血清中免疫球蛋白存在不同程度的提高；與對照組（硫酸銅：10 mg·kg-1）相比，飼喂CNP-Cu的能顯著提高仔豬血清補體C3水平（P＜0.05）；飼喂100 mg·kg-1劑量豬血清溶菌酶含量最高，提高28.70%（P＜0.05）[43]。飼喂檸檬酸銅20 mg·kg-1可使仔豬的腹瀉發生率降低71.57%，血清溶菌酶濃度升高170.73%（P＜0.05）[44]。蛋白質螯合銅按30%或100%替代硫酸銅飼喂生長肥育發現，蛋白質螯合銅能提高豬免疫器官指數；完全替代硫酸銅飼喂能顯著提高淋巴細胞計數、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞平均血紅蛋白含量以及紅細胞平均血紅蛋白濃度等血常規指標（P＜0.05），且完全替代，血紅蛋白濃度顯著高于30%替代（P＜0.05）；完全替代顯著提高了十二指腸、空腸的淋巴細胞數量，且十二指腸淋巴細胞數量高于30%替代（P＜0.05）[45]。

4.3 飼料銅類型對豬抗氧化性能的影響

銅是血漿銅藍蛋白和銅鋅超氧化物岐化酶的組成成分，其參與機體的抗氧化反應，能有效清除體內的超氧離子和自由基[46]。

研究發現，小肽螯合銅代替無機硫酸銅飼喂肥育豬，可顯著降低蛋白質羰基濃度顯著降低（P＜0.05）；降低堿性磷酸酶（AKP）活性（P=0.05）；顯著降低血清中谷丙轉氨酶（ALT）活性（P＜0.05）[36]。飼料中添加CNP-Cu能改善斷奶仔豬抗氧化能力，通過顯著提高血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和血清總抗氧化能力（T-AOC）來提高仔豬的抗氧化能力[47]。對仔豬飼喂檸檬酸銅30、60、120和240 mg·kg-1發現，隨著銅濃度增加，顯著降低血清中血清丙二醛（MDA）濃度（P＜0.05）和谷胱甘肽過氧化物酶的活性（P＜0.01）；增加血清銅鋅超氧化物歧化酶（SOD，P＜0.01）；降低肝組織中MDA的濃度（P＜0.01）；增加血清高密度脂蛋白的濃度（P＜0.01）[48]。日糧中添加CuSO4100%、蛋白螯合銅30%和蛋白螯合銅100%飼喂豬，結果表明，蛋白螯合銅讓豬脾臟中SOD的活性分別提高14.80%和17.40%（P＜0.05），且能顯著降低脾臟MDA的含量（P＜0.05），飼喂蛋白螯合銅100%還可降低豬肝臟MDA含量（P＜0.05）[49]。

5 微生物銅

隨著國家環境保護力度的不斷加大，低殘留的有機銅飼料添加劑先后被開發出來，如羥基氯化銅、氨基酸螯合銅、殼聚糖銅銅等，這些有機銅具有水溶性強、易消化吸收等優點[5,23,50]。但是這些有機銅源生產成本高[51]。因此，研發既高效又經濟的飼用有機銅添加劑，對促進綠色飼料添加劑的發展具有重要的現實意義。

研究發現，微生物能富集轉化無機銅為微生物有機銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡單和成本低等優點[7]。自然環境中微生物種類多且繁殖速度快，并且能夠在各類污染物存在的不良環境中適應并生長，對土壤中的重金屬具有較強的生物轉化和生物吸附作用[52]。細菌、真菌都有耐銅作用，且大多存在于銅礦廢棄地等高銅污染的土壤中，具有分布廣泛、種類繁多、表面積大、帶電、繁殖快速和代謝旺盛等特點，在生長過程中會不斷向體外分泌小分子有機酸、無機酸和代謝中間產物，并可以通過對重金屬的吸附富集、氧化還原、成礦沉淀和協同植物吸收等作用來完成對銅吸附代謝去除[53-55]。

通過細菌的吸附動力學研究發現不動桿菌USTB-F對銅具有較強的吸附和富集能力，且吸附的銅離子84.97%分布在細胞質內，對銅的最高耐受濃度可達560 mg·L-1[56]。在高酸性廢水中，銅濃度10 mg·L-1，硫酸還原菌對銅的去除達99.9%[57]。克雷伯氏桿菌在強酸條件對銅也具有較強的去除能力，銅濃度100 mg·L-1，pH 3時，去除率達到59.7%，通過吸附模型發現，吸附的銅離子有92.3%分布在細胞壁上，其余7.7%分布在細胞質內[58]。黑曲霉對銅也具有很強的吸附能力，Cu濃度為200 mg·L-1時，黑曲霉TLSF2對Cu的吸附量最大，達17.76 mg·g-1。利用紅外光譜檢測發現，細胞壁富集銅的主要部位，主要通過羧基、氨基和羥基來吸附[59]。

目前微生物富銅大多用于環境的凈化研究，而做為飼料的微生物銅主要研究為酵母銅[60]。利用酵母菌對銅富集得到酵母銅，除其本身富集有高含量的銅元素外可提供酵母銅外，酵母菌本身還可提供大量的菌體蛋白、多肽、小肽、氨基酸、豐富的B族維生素、消化酶以及其他生物活性物質。其細胞壁還含有甘露寡糖，對動物的健康也具有重要作用。對釀酒酵母的富銅研究發現，在銅濃度1.5 mg·mL-1的YPD培養基中培養48h，菌體中銅含量可達11.74 mg·g-1[61]。此外，酵母銅具有良好的穩定性，與日糧中其他組分配伍性好、吸收率高、排泄率低并對對環境污染小。試驗發現，與硫酸銅相比，酵母銅能顯著提高肉雞肝臟、胰臟和腎臟銅濃度，說明酵母銅具有較高的利用率。日糧中添加50 mg·kg-1酵母銅，在提高仔豬的生長性能和抗氧化酶活性方面與添加250 mg·kg-1硫酸銅作用效果相似，都能顯著增加血清中CuZn-SOD和銅蘭蛋白的活性[62]。酵母銅還能提高肝臟鐵和鋅的濃度，能有效促進鐵和鋅的利用率[63]。

6 展望

目前飼料中的微生物銅主要為酵母銅，酵母銅的篩選主要是利用傳統的飼用微生物作為資源進行馴化，通過長時間銅誘導培養來獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩定性差，易退化，富銅能力也會隨之下降。因此，應對飼用微生物富集銅繼續進行研究，以期為提供高效廉價、穩定、含銅高的微生物銅提供生產提供理論依據。