油茶果殼多糖乙醇提取工藝的優(yōu)化及其吸濕保濕性能

陳景斯，李奕彤，王曉佳，蔡延渠，黃晶晶，朱志東，董碧蓮

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市番禺區(qū)婦幼保健院，廣東 廣州 511400；3.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006）

油茶Camellia oleiferaAbel.是山茶科山茶屬植物，為多年生小喬木或灌木，在全國(guó)各地均有種植，以湖南、江西等省份產(chǎn)量最高。油茶果殼為油茶籽的外種皮，約占油茶果實(shí)總質(zhì)量的一半多，主要成分有木質(zhì)素、多縮戊糖、茶皂素、鞣質(zhì)等［1-2］，具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗腫瘤、降血糖［3-6］等生物活性，目前它主要用于制備糠醛、木糖醇、栲膠、活性碳、培養(yǎng)基等，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益均比較低，嚴(yán)重影響了種植戶(hù)的積極性。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多糖物質(zhì)具有較好的吸濕保濕性能及營(yíng)養(yǎng)肌膚、無(wú)刺激等作用，在化妝美容產(chǎn)品、術(shù)后創(chuàng)傷修復(fù)［7］等領(lǐng)域中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，為了更好地提高油茶果殼附加值，有效增加經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，本實(shí)驗(yàn)從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化油茶果殼多糖的乙醇提取工藝，同時(shí)對(duì)其吸濕保濕性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為該成分在保健、護(hù)膚等方面的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UV-1700 雙光束紫外分光光度計(jì)［島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司］；EPED-10TF 純水器（南京益普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；D05 臺(tái)式大容量低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；BP-211D 電子分析天平（德國(guó) Sartorius 公司）；JJ1000Y 電子天平［0.01 g，美國(guó)雙杰（兄弟）集團(tuán)有限公司］；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 油茶果殼產(chǎn)地廣東龍川，由廣東龍川恒海油脂有限公司提供，采集期為2016年10月，經(jīng)廣東藥科大學(xué)李苑新副研究員鑒定為山茶科山茶屬植物油茶Camellia OleiferaAbel.的干燥果殼。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833-201506），苯酚、濃硫酸、海藻酸鈉、氯化鈣、醋酸鉀、硫酸銨、無(wú)水乙醇、氯化鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖提取物制備 果殼在60 ℃下烘干后粉碎，過(guò) 80 目篩，精密稱(chēng)取 20 g 于圓底燒瓶中，加入30 倍量60%乙醇浸泡1 h，100 ℃下加熱回流提取 3 次，每次 1 h，合并濾液，抽濾后取上清液濃縮至適量，冷凍干燥至恒定質(zhì)量，粉碎，過(guò)100 目篩，即得。

2.2 多糖含有量測(cè)定［8-9］

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液 將D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品烘干至恒定質(zhì)量，精密稱(chēng)取10.09 mg 于100 mL 量瓶中，純水溶解，定容，即得（0.100 9 mg／mL）。

2.2.1.2 供試品溶液 將多糖提取物烘干至恒定質(zhì)量，精密稱(chēng)取 50.33 mg 于 200 mL 量瓶中，180 mL 純水超聲溶解，定容，即得（0.251 7 mg／mL）。

2.2.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 吸取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，加入純水 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL，再依次加入 5% 苯酚 1.0 mL、濃硫酸 5.0 mL，沸水浴20 min，取出冷卻至室溫；另外吸取純水1.0 mL，加入等量苯酚、濃硫酸同法操作，作為空白對(duì)照。然后，取各溶液適量于比色皿中，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.069X＋0.021（R2=0.999 0），在2.88～10.09 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 吸取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度 6次，測(cè)得其RSD 為0.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，平行6 份，各吸取 1.0 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其 RSD 為0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，吸取 1.0 mL，每隔0.5 h 按 “2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，連續(xù) 4 h，測(cè)得其 RSD 為0.85%，表明供試品溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 吸取 “2.2.2”項(xiàng)下含有量已知的多糖溶液0.50 mL，加入0.100 9 mg／mLD-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.18、0.23、0.28 mL 和純水 1.32、1.27、1.22 mL，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其平均加樣回收率分別為98.37%、98.62%、98.65%，RSD 分別為 0.33%、0.42%、0.35%。

2.2.7 多糖得率測(cè)定［10］將多糖溶液按 “2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖質(zhì)量，再測(cè)定其得率，公式為得率=（溶液中多糖質(zhì)量／果殼質(zhì)量）×100% 。

2.3 單因素試驗(yàn)［11-12］

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱(chēng)取40 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶20 加入 30%、40%、50%、60%、70% 、80% 乙醇，浸泡 1 h 后提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，多糖得率明顯上升，在60%時(shí)達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on polysaccharides yield

2.3.2 粉末粒徑 稱(chēng)取 24、40、60、80、100、120 目果殼粉末 20 g，按料液比 1 ∶20 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察粉末粒徑對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，隨著粉末粒徑減小，多糖得率逐漸提高，在80 目時(shí)最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 粉末粒徑對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of powder particle size on polysaccharides yield

2.3.3 提取溫度 稱(chēng)取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶20 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后于 60、70、80、90、100 ℃下回流提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察提取溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，隨著提取溫度升高，多糖得率呈上升趨勢(shì)，在100 ℃時(shí)最高。

2.3.4 料液比 稱(chēng)取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后 100 ℃ 下提取1 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察料液比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，隨著料液比增加，多糖得率呈上升趨勢(shì)，在1 ∶30時(shí)程度趨緩。

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖4 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.3.5 提取時(shí)間 稱(chēng)取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶30 加入 60%乙醇，浸泡1 h 后100 ℃下提取 1、2、3、4 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，多糖得率開(kāi)始明顯上升，2 h 后有所下降。

圖5 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on polysaccharides yield

2.3.6 提取次數(shù) 稱(chēng)取80 目果殼粉末20 g，按料液比1 ∶30 計(jì)算60%乙醇總量，根據(jù)提取次數(shù)平均分配加入量，浸泡 1 h 后 100 ℃下提取 1、2、3、4次，每次 1 h，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備多糖溶液，考察提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知，多次提取有利于提高多糖得率，其中提取2 次時(shí)最高，但次數(shù)過(guò)多時(shí)損耗增加，反而導(dǎo)致其下降。

圖6 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of extraction frequency on polysaccharides yield

2.4 正交試驗(yàn)［10-11］根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)方式，本實(shí)驗(yàn)固定粉末粒徑、提取溫度分別為80 目、100 ℃，并選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）作為影響因素，采用 L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

直觀分析（表2）顯示，各因素影響程度依次為 A＞D＞C＞B；方差分析（表3）顯示，因素 A 具有顯著性差異（P＜0.05），最優(yōu)工藝為 A2B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶35，提取2 次，提取時(shí)間1.5 h。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

然后，按優(yōu)化工藝（平行稱(chēng)取一定量80 目果殼粉末 3 份，按料液比 1 ∶35 加入 60% 乙醇，浸泡1 h 后 100 ℃下提取 2 次，每次 1.5 h）進(jìn)行 3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of verification tests（n=3）

2.5 吸濕保濕性能研究［13-15］

2.5.1 吸濕性能 將飽和醋酸鉀、硫酸銨溶液于室溫下置于干燥器中預(yù)飽和12 h，分別形成相對(duì)濕度43%、81%的環(huán)境。精密稱(chēng)取多糖粉末、海藻酸鈉各2.0 g 于培養(yǎng)皿中，平行制備3 份樣品，置于以上不同濕度的干燥器內(nèi)，于 1、3、6、9、12、18、24、36、48 h 取出稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率，公式為吸濕率=［（Wn-W0）／W0］×100%（W0、Wn分別為樣品放置前、放置后的質(zhì)量）。

圖7顯示，相對(duì)濕度 43% 下多糖在 0～6 h 內(nèi)的吸濕率與海藻酸鈉趨于平行，6～12 h 內(nèi)緩慢上升，12 h 后加快，但增幅均低于后者。整體而言，0～48 h 內(nèi)海藻酸鈉吸濕率大于多糖，上升趨勢(shì)線(xiàn)k值分別為2.743、2.425，但兩者無(wú)明顯差異。

圖7 相對(duì)濕度43%下樣品吸濕曲線(xiàn)Fig.7 Moisture-absorption curves for samples under the relative humidity of 43%

圖8顯示，相對(duì)濕度81%下多糖在 0～12 h 內(nèi)的吸濕率略低于海藻酸鈉，12～36 h 內(nèi)略高于后者，36～48 h 內(nèi)又略低于后者。整體而言，0～48 h內(nèi)多糖吸濕率大于海藻酸鈉，上升趨勢(shì)線(xiàn)k值分為4.693、4.296，但兩者無(wú)明顯差異。

圖8 相對(duì)濕度81%下樣品吸濕曲線(xiàn)Fig.8 Moisture-absorption curves for samples under the relative humidity of 81%

2.5.2 保濕性能 將飽和氯化鈣溶液于室溫下置于干燥器中預(yù)飽和12 h，形成相對(duì)濕度34% 的環(huán)境。精密稱(chēng)取多糖粉末、海藻酸鈉各2.0 g，加入1.0 g 純水制成樣品溶液，平行 3 份，稱(chēng)取 2.0 g，涂布于貼在培養(yǎng)皿底部的透氣膠帶上，于1、3、6、9、12、18、24、36、48 h 取出稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率，公式為保濕率=Hn／H0×100%（H0、Hn分別為樣品放置前、放置后的水分質(zhì)量）。

圖9顯示，相對(duì)濕度34%下海藻酸鈉、多糖在0～48 h 內(nèi)的保濕率均不斷下降，前者高于后者，并且后者下降速率（k=-9.403）略快于前者（k=-8.705）。

圖9 相對(duì)濕度34%下樣品保濕曲線(xiàn)Fig.9 Moisture-retention curves for samples under the relative humidity of 34%

3 討論

油茶果殼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等多種不同單糖組成的雜多糖［5］，故溶劑極性、pH 值可能影響其溶出。預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)水、乙醇、酸水（pH 3～6）、堿水（pH 8～11）等不同溶劑進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)以乙醇為溶劑時(shí)對(duì)油茶果殼多糖的提取效果最佳，而且在單因素、正交試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最顯著；本實(shí)驗(yàn)篩選出的最優(yōu)提取工藝為80 目粉末，料液比1 ∶35，60% 乙醇 100 ℃ 下提取 2 次，每次 1.5 h，驗(yàn)證試驗(yàn)顯示該工藝合理可行，準(zhǔn)確穩(wěn)定，可為相關(guān)大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

研究表明，隨著環(huán)境濕度增加，油茶果殼多糖吸濕性能提高，與海藻酸鈉接近，但保濕效果稍差于后者，其原因主要是該成分高分子鏈上的基團(tuán)與水分子之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，使水分子比較容易進(jìn)入凝膠，同時(shí)氫鍵作用使得整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的高分子鏈相互纏繞，之后逐漸解開(kāi)后分散到水溶液中，可發(fā)生鏈間、水分子與鏈段之間相互作用的變化，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸水能力。