醋制蓬莪術中總姜黃素回流提取工藝的優化

高天慧，陳雯清，陳詩韻，廖 婉，傅超美

（成都中醫藥大學藥學院，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137）

蓬莪術Curcuma phaeocaulisVal.為川產道地藥材，是2015年版 《中國藥典》 收載的莪術主要來源之一，具有行氣破血、消積止痛功效，常用于治療飲食積滯、痞滿呃逆等癥［1］，經醋制后行氣破血之力更勝，而且峻猛藥性減緩［2-7］，揮發油、總姜黃素為其主要有效成分，其中前者以吉馬酮、莪術烯、莪術酮、莪術醇、β-欖香烯等為代表［8-9］，而后者以雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素等為代表［10］。前期研究發現，蓬莪術對刀豆蛋白A 所致免疫性肝損傷具有良好的保護作用，并且經醋制后利肝抗炎活性增強［11］；姜黃素和雙去甲氧基姜黃素是該藥材主要藥效成分［12］，而且前者含有酚羥基和烯醇式羥基，可阻斷氧化反應中自由基鏈式反應，從而發揮抗氧化自由基作用［13］。本實驗通過正交試驗結合人工神經網絡優化醋制蓬莪術中總姜黃素回流提取工藝，以期為后續該藥材炮制機理研究及相關制劑開發奠定基礎。

1 材料

電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，型號CPA225D］；純水機（優普純水系統上海分公司，型號 UPK-I-10T）；高效液相色譜儀（日本島津公司，型號LC-2030C3D）；旋轉蒸發儀（上海泉杰儀器有限公司，型號 OSB-2100）。雙去甲氧基姜黃素（CAS號 33171-05-0，批號140613）、去甲氧基姜黃素（CAS號 24939-17-1，批號 140815）、姜黃素（CAS號 458-37-7，批號140612）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，含有量均≥98%。蓬莪術采自道地產區四川省，經成都中醫藥大學中藥標本中心蔣桂華教授鑒定為蓬莪術Curcuma phaeocaulisVal.。乙腈為色譜純（美國Sigma-Aldrich 公司）；冰醋酸（成都市聯合化工試劑研究所，批號 201411041）；9°米醋（佛山市海天調味食品股份有限公司，批號20150210）。

2 方法與結果

2.1 醋制蓬莪術制備 采用前期專利（公開號CN103463567A）報道的方法［14］，取適量生品，加入9°米醋（用量30%）拌勻悶潤2 h，煮至醋液收干，120 ℃ 下干燥 30 min，取出，稍冷后干燥，即得［15］。

2.2 總姜黃素制備 取去油醋制品藥渣100 g，按不同體積分數乙醇、提取時間、提取次數進行試驗，濾棄藥渣，合并濾液，濃縮成稠浸膏，即得。

2.3 總姜黃素含有量測定

2.3.1 色譜條件［1］Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-4% 冰醋酸（48 ∶52）；體積流量 1 mL／min；檢測波長430 nm；柱溫 25 ℃；進樣量 10 μL，色譜圖見圖1，可知上述條件下各成分色譜峰分離度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對照品適量，置于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 8 mL，40 kHz 下超聲溶解混勻，定容，作為貯備液，各取2 mL 于10 mL 棕色量瓶中，定容，混勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備［16-17］取 “2.2”項下 9份稠浸膏，每份 1 g，置于 100 mL 錐形瓶中，精密加入 50 mL 甲醇，搖勻，密塞，稱定質量，超聲1 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 線性關系考察 取 “2.3.2”項下貯備液，倍比稀釋成系列質量濃度對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度試驗 取 “2.3.2”項下對照品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定 6 次，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為0.09%、0.12%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取同一批稠浸膏，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為1.85%、0.81%、0.46%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一批稠浸膏，同法提取后在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為1.04%、0.17%、0.14%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量已知的稠浸膏 6 份，加入對照品溶液，按 “2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.4 正交試驗 選擇乙醇體積分數（A）、乙醇用量（B）、提取次數（C）、提取時間（D）作為影響因素，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量作為評價指標，設計 L9（34）表，因素水平見表3，結果見表4，方差分析見表5。由此可知，各因素影響程度依次為A＞C＞B＞D，因素 A對各成分含有量有顯著影響（P＜0.05），最優工藝是 A3B1C1D1，即加入 3 倍量 95% 乙醇提取 1 次，每次1 h。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 試驗設計及結果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.5 人工神經網絡法 以 “2.4”項下數據為訓練樣本，建立人工神經網絡模型，以乙醇體積分數、乙醇用量、提取次數、提取時間為輸入節點，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量為輸出節點，建立并訓練該網絡模型。再以縱坐標為網絡數據預測，橫坐標為正交試驗結果，發現實驗數據基本都集中分布在實線與虛線重疊的直線上，理想回歸直線與最優回歸直線幾乎全部重合（相關系數分別為 1、0.999 9、1），而且網絡期望輸出和實際輸出的相對誤差均小于1%，表明其性能和預測能力良好，最優工藝加入3 倍量95%乙醇提取 2 次，每次 2 h。

2.6 驗證試驗 稱取6 份去油醋制品藥渣，每份100 g，分別按正交試驗、人工神經網絡優化工藝平行3 次驗證試驗，測得雙去甲氧基姜黃素含有量分別為 1.00 μg／mL（RSD=0.42% ）、1.12 μg／mL（RSD=0.14%），去甲氧基姜黃素含有量分別為17.52 μg／mL（RSD=0.43%）、19.83 μg／mL（RSD=1.06%），姜黃素含有量分別為 28.29 μg／mL（RSD=0.43%）、30.00 μg／mL（RSD= 1.04%）。由此可知，人工神經網絡優化后各成分含有量較高，重復性較好。

3 討論與結論

人工神經網絡是模擬生物學中大腦和神經系統的一種算法模型，廣泛用于信息處理與分析，由接受信息的輸入層、輸出信息的輸出層以及中間隱含層構成，見圖2。該方法在處理非線性問題上獨具優勢，能很好地反映對象輸入、輸出之間復雜的非線性關系［18］，很多學者將傳統方法（如正交試驗）與其相結合來模擬試驗過程，可減少大量反復的驗證性工作，更方便快捷地獲得多因素連續區域中的最優組合［15，19-20］。

圖2 人工神經網絡模型結構Fig.2 Model structure of artificial neural network

本實驗結合人工神經網絡與正交試驗，得到醋制蓬莪術中總姜黃素最優回流提取工藝為加入3 倍量95%乙醇提取2 次，每次2 h，人工神經網絡優化后雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量分別為 1.12、19.83、30.00 μg／mL，均高于正交試驗優化后，而且該方法穩定可行，重復性好。但目前對醋制蓬莪術中提取得到的總姜黃素缺乏一套完整的質量標準控制體系，仍未將體外提取工藝和體內藥效學表征有機結合起來，醋制后破血消癥功效增強的物質基礎和體內具體的作用機制尚不清楚，亟待更深入考察。