通腑泄?jié)岱▽?duì)慢性腎臟病大鼠TGF-β1／p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

于 翔，戴銘卉，劉 猛，包 能，孔 薇?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001）

腎臟纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)入終末期的必經(jīng)過程，故延緩其進(jìn)展對(duì)治療慢性腎臟病而言具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）／促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）是腎臟纖維化過程中重要的信號(hào)通路，其中前者不僅作為上游因子參與激活后者信號(hào)通路，同時(shí)活化的后者信號(hào)通路會(huì)誘導(dǎo)反向產(chǎn)物前者生成增多，故阻斷該信號(hào)通路對(duì)延緩慢性腎臟病病程進(jìn)展具有重要意義。

通腑泄?jié)岱ㄊ桥R床常用治療慢性腎臟病的中醫(yī)療法，通腑泄?jié)岱绞悄暇┦兄嗅t(yī)院腎內(nèi)科協(xié)定方，由生大黃、生牡蠣、熟附子、蒲公英、生槐米、六月雪組成，該方以 《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中 “開鬼門，潔凈府”的理論為治療原則，緊扣 “濁毒”病機(jī)，結(jié)合傳統(tǒng)方義和現(xiàn)代藥理，以大黃為君藥，結(jié)合諸藥共奏清熱利濕、通腑泄?jié)嶂πА１緦?shí)驗(yàn)選用通腑泄?jié)岱郊按簏S作為通腑泄?jié)岱ù矸絼^察該方法對(duì) TGF-β1／p38MAPK 信號(hào)通路的影響及對(duì)腎臟纖維化的改善作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí) 8 周齡雄性 SD 大鼠 30 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自浙江省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào) SCXK（浙）2014-0001］，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心［許可證號(hào) SYKX（蘇）2014-0001］，自由攝食飲水，封閉管理。實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)喂養(yǎng)1 周。

1.2 試藥 腺嘌呤（美國 Amresco 公司，批號(hào)0183）。大黃、牡蠣、附子、蒲公英、槐米、六月雪配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司）。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，批號(hào) ab5694）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ，批號(hào) ab34710 ）、GAPDH（批號(hào)ab181602）抗體及大鼠胱抑素 C ELISA 試劑盒（批號(hào) ab201281）（英國 Abcam 公司）；TGF-β1 抗體（美國 Santa Cruz 公司，批號(hào) sc-130348）；p38MAPK（批號(hào) 8690S）、p-p38MAPK 抗體（批號(hào)4511S）（美國 CST 公司）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗鼠抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；大鼠 TGF-β1、IL-6 ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；硫酸吲哚酚對(duì)照品（美國Sigma 公司）。

1.3 儀器 515 型高效液相色譜儀、2475 型熒光檢測(cè)器、XBridge BEH C18色譜柱（美國 Waters 公司）；MS105DU 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ELX800 酶標(biāo)儀（美國 BioTek 公司）；CKX31 倒置式生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；高電流電泳儀、蛋白濕轉(zhuǎn)印儀（美國 Bio-Rad 公司）；ZD-9950 脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5810R 冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；7AN01446 純水儀（美國 Millipore 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 通過SPSS22.0 軟件將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、通腑泄?jié)岱ńM、大黃配方顆粒組，其中空白組 6 只，其余 3 組各 8 只。采用Yokozawa 法建立慢性腎臟病大鼠模型，即每天上午灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg／kg），第4 周周末每組隨機(jī)取2 只大鼠目內(nèi)眥檢測(cè) Scr、BUN 水平以評(píng)價(jià)造模情況，第5 周隔天灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg／kg）以維持病程進(jìn)展，至第7 周停止，在此期間空白組灌胃給予相應(yīng)體積蒸餾水，同時(shí)各組大鼠下午給予相應(yīng)藥物治療。根據(jù)人和動(dòng)物等效劑量比值，按照成人給藥劑量計(jì)算給藥量，通腑通腑泄?jié)岱ńM為大黃配方顆粒0.6 g／kg、牡蠣配方顆粒 0.045 g／kg、附子配方顆粒 0.15 g／kg、蒲公英配方顆粒 0.36 g／kg、槐米配方顆粒 0.54 g／kg、六月雪配方顆粒 0.09 g／kg，大黃配方顆粒組為0.6 g／kg，將上述配方顆粒溶于10 mL 蒸餾水中制成混懸液，按照 10 mL／kg 劑量每天灌胃給藥，空白組、模型組大鼠下午灌胃給予等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)過程中，模型組、通腑泄?jié)岱ńM、大黃配方顆粒組均死亡2 只大鼠。

2.2 標(biāo)本采集 第8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉（0.2 mL／100 g），麻醉后腹主動(dòng)脈取血，保存于促分離采血管中，靜置30 min 后，3 000 r／min 離心 10 min 取上清液送檢。采血結(jié)束后，摘取大鼠雙側(cè)腎臟，剔除腎周筋膜組織，生理鹽水清洗殘余血液，于腎門處縱行剖開腎臟，4%多聚甲醛固定24 h，制作病理切片，分別進(jìn)行HE、Masson 染色；其余腎臟組織置于無菌凍存管中，放入液氮備用。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 高效液相色譜-熒光分析法檢測(cè)硫酸吲哚酚（IS），ELISA 法檢測(cè)胱抑素C（CysC）、白介素-6（IL-6）、TGF-β1，委托南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、同型半胱氨酸（HCY）、24 h 尿蛋白。

2.4 腎臟病理形態(tài)學(xué)變化 多聚甲醛固定的腎臟組織進(jìn)行脫水、包埋、切片后，分別進(jìn)行 HE、Masson 染色，觀察相關(guān)病理形態(tài)學(xué)變化。然后，Masson 染色選取圖片上藍(lán)色作為有效區(qū)域，每張切片隨機(jī)選取 6 個(gè) 200 倍視野，通過 Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，計(jì)算膠原纖維占整體視野面積的比例，以此作為判斷腎臟纖維化程度的指標(biāo)。

2.5 腎臟組織α-SMA、Col-I 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化技術(shù)，將石蠟包埋的切片常規(guī)脫蠟，抗原熱修復(fù)后血清封閉，分別滴加α-SMA、Col-I 抗體孵育過夜，滴加二抗，顯微鏡下控制DAB 液顯色，蘇木素復(fù)染。然后，在200 倍視野下每張切片隨機(jī)挑選6 個(gè)拍照，以棕黃色作為判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件分析陽性區(qū)域累積光密度值（IOD）。

2.6 腎臟 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取100 mg 腎臟組織剪碎，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的裂解液，組織勻漿后靜置 30 min 裂解，4 ℃ 下12 000 r／min離心 15 min，取上清液，按照 BCA 試劑盒說明書檢測(cè)蛋白濃度，然后按照相應(yīng)比例與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液統(tǒng)一配制成蛋白上樣品，煮沸10 min 使蛋白充分變性，根據(jù)說明書提示配制分離膠和濃縮膠，在泳道中加入蛋白樣品，置于盛有電泳液的電泳槽中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取下凝膠，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫下孵育1 h，10%TBST 洗滌3 次，每次 10 min，分別加入稀釋后的一抗［TGF-β1（1 ∶500）、p38MAPK（1 ∶1 000）、p-p38MAPK（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶10 000）］，4 ℃下孵育過夜，用 10%TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，加入相應(yīng)二抗［HRP 標(biāo)記的山羊抗兔（1 ∶2 000）和 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠（1 ∶2 000）］，室溫下孵育 2 h，TBST 洗滌 5 次，每次約 12 min，取出 PVDF 膜，將顯影液均勻地涂抹于膜上，曝光定影。然后通過Image J 軟件檢測(cè)灰度值，用于蛋白表達(dá)半定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差相齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用 Dunnett’s T3 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 圖1顯示，與空白組比較，模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)干枯脫落、行動(dòng)遲緩、精神萎靡等癥狀，其中體質(zhì)量更顯著（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńM大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠左腎與體質(zhì)量比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńM其比例顯著下降（P＜0.01）。

3.2 生化指標(biāo) 圖2顯示，與空白組比較，模型組 BUN、Scr、CysC、HCY、IS、24 h 尿蛋白、IL-6、TGF-β1顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńM上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠一般情況Fig.1 General conditions of rats in various groups

3.3 腎臟病理變化 圖3顯示，空白組大鼠腎臟形似蠶豆，色澤暗紅，光鏡下未見硬化腎小球；模型組大鼠腎臟體積增大，呈灰白色，表面粗糙，密布白色顆粒物，腺嘌呤代謝物結(jié)晶沉積于腎臟，大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎間質(zhì)纖維化，腎小管囊性擴(kuò)張，大量管腔閉塞，系膜增生明顯，符合腺嘌呤模型腎臟病理變化；通腑泄?jié)岱ńM、大黃配方顆粒組大鼠腎臟病理變化較模型組明顯減輕。Masson 染色顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎臟纖維化程度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńM大鼠腎臟纖維化程度顯著下降（P＜0.05）。

3.4 α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá) 圖4顯示，與空白組比較，模型組大鼠α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńMα-SMA 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），Col-Ⅰ蛋白表達(dá)也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠生化指標(biāo)Fig.2 Biochemical indices of rats in various groups

圖3 各組大鼠腎臟病理變化Fig.3 Renal pathological changes of rats in various groups

3.5 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋 白 表達(dá) 圖5顯示，與空白組比較，模型組 TGF-β1、pp38MAPK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄?jié)岱ńM兩者蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

4 討論

慢性腎臟病臨床表現(xiàn)與中醫(yī) “癃閉”“水腫”“腎勞”“溺毒”等病證相似，其病性為本虛標(biāo)實(shí)，病機(jī)為脾腎虧虛，濁毒內(nèi)蘊(yùn)，素體稟賦不足、情志內(nèi)傷、勞倦虛損等各種病因?qū)е缕⒛I虧虛、濕濁蘊(yùn)結(jié)、升降失司、濁毒內(nèi)蘊(yùn)而發(fā)病，內(nèi)生濁毒之邪進(jìn)而損傷腎元，累及腎絡(luò)，致使氣血運(yùn)行不暢，瘀血內(nèi)阻，腎失蒸騰氣化，開闔無度，濁毒排泄失司，蓄積體內(nèi)，進(jìn)一步加重腎臟損害，六腑以通為用，故施以通腑泄?jié)嶂ǎ箖?nèi)蘊(yùn)之濁毒從大腸排出體外，為防止?jié)岫驹俅涡罘e，通腑泄?jié)岱☉?yīng)結(jié)合辨證貫穿于整個(gè)治療。大黃作為通腑泄?jié)岱ǖ拇硭幬铮Ｓ糜谥委熉阅I臟病，通腑泄?jié)岱街性撍幉耐ǜ節(jié)幔钛觯墒箖?nèi)蘊(yùn)之濁毒排出體外，為君藥；生牡蠣收斂固澀，防大黃瀉下太過；熟附子益腎溫陽，扶助正氣，并防止苦寒瀉下之藥攻伐太過；蒲公英清熱解毒，散結(jié)消腫；生槐米涼血止血；六月雪清熱利濕、舒筋活絡(luò)，諸藥配伍，共奏通腑泄?jié)帷⒌瓭B利濕、活血化瘀、溫腎益氣之功效。前期研究顯示，泄?jié)岱娇山档拖汆堰收T導(dǎo)的慢性腎臟病大鼠尿毒癥毒素水平，延緩腎臟間質(zhì)纖維化進(jìn)展［1］。

圖4 各組α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)Fig.4 α-SMA and Col-Ⅰ protein expressions in various groups

圖5 各組 TGF-β1、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)Fig.5 TGF-β1 and p-p38MAPK protein expressions in various groups

研究表明，TGF-β1／p38MAPK 信號(hào)通路與腎臟炎癥及纖維化密切相關(guān)［2-3］，其中 p38MAPK 可通過調(diào)節(jié) TGF-β1、核因子-κB（NF-κB）等表達(dá)來影響腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，是腎纖維化的一條經(jīng)典途徑［4］，是 MAPK 家族中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活后磷酸化的p38MAPK（p-p38MAPK）參與應(yīng)激條件下細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和炎性反應(yīng)［5］；TGF-β1 通過激活成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加并抑制其分解，可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化［6-7］，作為 p38MAPK 通路上游的啟動(dòng)信號(hào)或下游的信號(hào)產(chǎn)物，它是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵，在通路上游通過激活p38MAPK 發(fā)揮其生物活性，而作為下游p38MAPK 信號(hào)通路的產(chǎn)物，TGF-β1 合成過多時(shí)可加劇腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，加速慢性腎臟病進(jìn)展［8］，而 p38MAPK 活化又可加重 TGF-β1 介導(dǎo)的小鼠小球系膜細(xì)胞腎損傷［9］，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡［10］。前期報(bào)道，大黃酸可有效抑制TGF-β1 所致間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，并抑制其誘導(dǎo)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA 和纖維連接蛋白（FN）合成［11］，同時(shí)還可通過干擾 p38MAPK 信號(hào)通路來抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤所致腎臟纖維化與TGF-β1／p38MAPK 信號(hào)通路過度激活相關(guān)，而通腑泄?jié)岱脚c大黃可抑制慢性腎臟病大鼠腎臟TGF-β1、p-p38MAPK 過度表達(dá)，延緩腎臟纖維化進(jìn)展，可能是通過抑制 TGF-β1／p38MAPK 信號(hào)通路所致；通腑泄?jié)岱ńM、大黃配方顆粒組大鼠腎臟α-SMA表達(dá)較模型組明顯降低，而Col-I 雖也有所下降但無明顯差異，表明該方法延緩腎臟纖維化的作用點(diǎn)可能與抑制早期腎臟纖維化相關(guān)，同時(shí)若膠原蛋白在腎臟大量沉積時(shí)，單純運(yùn)用通腑泄?jié)岱赡苁招跷ⅲ藭r(shí)應(yīng)結(jié)合患者病情予以補(bǔ)腎益氣、活血化瘀等法；通腑泄?jié)岱健⒋簏S均可降低血清IS，前者作用顯著更強(qiáng)，同時(shí)腸源性尿毒癥毒素IS 也參與誘導(dǎo)腎臟纖維化［13］，通腑泄?jié)岱ńM腎臟纖維化程度低于大黃配方顆粒組也可能也與此相關(guān)，而且單味大黃治療可改善大鼠體質(zhì)量，降低 BUN、CysC、24 h 尿蛋白，但對(duì)于降低單腎與體質(zhì)量比例、Scr、HCY 仍顯不足，可能與樣本量偏小有關(guān)，也提示單味大黃雖然對(duì)慢性腎臟病具有療效，但仍有局限，而進(jìn)行相應(yīng)組方配伍后各項(xiàng)指標(biāo)改善均較明確，其機(jī)制可能與組方后所具有的多途徑、多靶點(diǎn)治療作用相關(guān)，同時(shí)也提示臨床上單味藥治療病癥時(shí)需根據(jù)實(shí)際情況加以辨治，切勿讓中醫(yī)藥治療囿于機(jī)械。

通腑泄?jié)岱ㄖ委熉阅I臟病的潛在機(jī)制并非單純?yōu)a下排毒之功，仍宗去邪以安正之理，該方法不僅局限于祛邪排毒之效，更重要的在于其扶正護(hù)腎之力，潛在機(jī)制可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：（1）調(diào)節(jié)腸道菌群，參與腸源性毒素的代謝，降低患者血清中毒素含有量；（2）調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的炎癥因子IL-6、TGF-β1，從而減輕炎癥反應(yīng)、腎臟損害，并改善微炎癥狀態(tài)；（3）抑制促纖維化因子、腎臟纖維化相關(guān)信號(hào)通路及蛋白表達(dá)，從而延緩腎臟纖維化；（4）降低尿蛋白排泄，減輕尿蛋白對(duì)腎小管的損傷，抑制補(bǔ)體激活及細(xì)胞凋亡，保護(hù)足細(xì)胞，從而保護(hù)腎臟。

綜上所述，通腑泄?jié)岱汕宄阅I臟病大鼠尿毒癥毒素，降低24 h 尿蛋白，減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)，并延緩腎臟纖維化進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1／p38MAPK 信號(hào)通路有關(guān)。