黃連解毒湯含藥血清對Aβ25-35誘導HT22細胞損傷的影響

張茹蘭，黃啟輝?，黃秀芳，李建軍，陶彥谷

（1.中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東 廣州 510300；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510080）

阿爾茨海默病是以記憶喪失、認知障礙為臨床表現的神經退行性疾病，主要病理特征之一是細胞外Aβ 沉積形成老年斑，導致廣泛海馬神經元缺失［1］，β 淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）是 Aβ 毒性片段之一，對體外培養、在體神經細胞均具有毒性作用［2］，在發病過程中神經元損傷與氧化應激和線粒體凋亡途徑密切相關［3］。阿爾茨海默病屬中醫“癡呆”范疇，王永炎院士 “毒損腦絡”理論認為，腦為 “清靈之府”，受穢氣濁毒侵襲，體內痰濁、瘀血等化熱成毒，導致腦竅壅塞、神機失用而發為癡呆［4］。

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，功效清熱解毒。為了探究該方含藥血清的神經保護作用，闡明其治療阿爾茨海默病的作用機制，本實驗采用Aβ25-35建立細胞模型，觀察它對HT22 細胞（是小鼠海馬神經元細胞系，分化后的HT22 細胞是具有功能性的膽堿能神經元，是能夠很好地進行認知功能障礙研究的體外模型［5］）存活率，氧化應激關鍵指標超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），線粒體凋亡關鍵指標 Bcl-2、Bax、Cyt C、Caspase-3 的影響，初步探討其神經保護作用及機制，為相關臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 動物 3月齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 40 只，體質量（200±20）g，購自中山大學實驗動物中心，清潔級飼養，實驗動物許可證號 SCXK（粵）2004-0011，本實驗經中山大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物 黃連解毒湯由黃連9 g、黃芩 6 g、黃柏 6 g、梔子9 g 組成，由中山大學孫逸仙紀念醫院中藥制劑中心提供（批號分別為 20110802、20110413、20110616、20110919）。按處方量稱取藥材，蒸餾水煎煮，水煎液濃縮至1 ∶2 時停止，待藥液放冷后，邊攪拌邊緩慢加入乙醇使含醇量達50%，靜置48 h 后濾取上清液，回收乙醇，蒸餾水配制成生藥量為6.48 g／mL，臨用前加蒸餾水分別稀釋成 0.27、0.81 g／mL 溶液。鹽酸多奈哌齊（5 mg／片，衛材中國藥業有限公司，批號100801053），臨用前加蒸餾水稀釋成 0.09 mg／mL溶液（它為乙酰膽堿酯酶抑制劑，具有神經保護作用［6］，為臨床治療阿爾茨海默病常用藥物，故選擇其作為陽性對照）。

1.3 試劑 Aβ25-35、DMSO（美國 Sigma 公司）；DMEM 培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；PBS 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；SOD、GSH-Px、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；β-action，Bax，Bcl-2，Cyt C、Caspase-3 抗體（美國Proteintech 公司）。

1.4 儀器 Galaxy 170S CO2細胞培養箱（德國Eppenddorf 公司）；Reader M3 多功能酶標儀（美國 Molecular Devices 公司）；HWS-12 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；SW-CJ-1F 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 方法

2.1 Aβ25-35溶液制備 Aβ25-35溶于去離子水中，0.22 μm 微孔濾膜過濾，37 ℃下于孵化器中孵育7 d 后，-20 ℃ 下避光保存。文獻［7］報道，40 μmol／L Aβ25-35作用于分化及未分化的 HT22 細胞24 h 時約為半抑制濃度，故可建立較理想的阿爾茨海默病細胞模型。

2.2 含藥血清制備 40 只大鼠隨機分為空白組、模型組、多奈哌齊組及黃連解毒湯低、高劑量組，每組8 只，用藥劑量按動物體表面積比率換算等劑量法，黃連解毒湯低、高劑量組大鼠分別以成人等效劑量的 1、3 倍灌胃給藥，即 2.7、8.1 g／kg，多奈哌齊組大鼠灌胃給予0.09 mg／mL 藥物，空白組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水，各組大鼠每次灌胃 2 mL，1 次／d，連續 7 d。最后 1 次給藥 3 h 后，大鼠腹主動脈穿刺取血，離心，取上清，除菌，滅活，-20 ℃下保存備用。

2.3 細胞培養 HT22 細胞由中山大學孫逸仙紀念醫院神經內科劉軍教授惠贈，培養于中山大學孫逸仙紀念醫院實驗室，在37 ℃、5%CO2條件下于含10%FBS 的 DMEM 培養基中培養，每 2 d 更換 1 次培養基。將細胞隨機分為空白組、模型組，多奈哌齊組及黃連解毒湯低、高劑量組，其中空白組、模型組大鼠給予含10% 空白血清的DMEM 培養基，多奈哌齊組給予含10%藥物血清的DMEM 培養液，黃連解毒湯低、高劑量組大鼠分別給予含10% 藥物低、高劑量血清培養基。培養1 h 后，空白組加無血清DMEM 培養液，其他各組加 Aβ25-35使其終濃度為 40 μmol／L，孵育 24 h。

2.4 細胞活性檢測 采用MTT 法。取HT22 細胞，以 2.5×103／孔密度接種于 96 孔板中（100 μL／孔），分組同上，接種 12 h 后給予含藥血清、Aβ25-35處理，24 h 后各組均加入 20 μLMTT（5 mg／mL，溶于 0.01 mol／L PBS 緩沖液中），繼續培養4 h后測定各孔光密度（OD 值），檢測波長為570 nm。

2.5 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平檢測 采用比色法。取 HT22 細胞，以 5×103／孔密度接種于96 孔板中培育 12 h，每孔體積 100 μL，分組同上，12 孔／組，含藥血清、Aβ25-35處理 24 h 后，取各組細胞上清液，4 ℃、1 500 r／min 下離心 10 min，嚴格按照試劑盒說明書檢測。

2.6 Bax、Bcl-2、Cyt C、Caspase-3 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。HT22 細胞于6 孔板中培養 12 h，密度為 1×105／孔，含藥血清、Aβ25-35處理后，按照文獻［8］方法提取蛋白，進行12% SDSPAGE 凝膠電泳，濃縮膠 90 V，分離膠 120 V；電轉至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫下封閉 1 h，TBST（含 10 mmol／L Tris-HCl、150 mmol／L NaCl、0.5% Tween-20，pH 7.5）洗滌 3 次，每次 5 min，加抗體Bax、Bcl-2、Cyt C、Caspase-3（1 ∶2 000）、β-actin（1 ∶2 000），4 ℃ 冰箱中過夜；TBST 洗膜3 次，每次 5 min；加兔二抗（1 ∶2 000），室溫下反應 2 h；TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；滴加 ECL發光液，GE 凝膠成像系統測量各目的條帶灰度值，計算其與內參β-actin 蛋白灰度值之比。

2.7 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（）表示，各組比較采用單因素方差分析，組間差異多重比較采用SNK 法，檢驗水平α=0.05。P＜0.05 差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃連解毒湯對HT22 細胞活性的影響 表1、圖1顯示，與空白組比較，模型組HT22 細胞活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃連解毒湯組其活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯（P＜0.01）。

表1 黃連解毒湯對HT22 細胞活性的影響（， n=12）Tab.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability（， n=12）

表1 黃連解毒湯對HT22 細胞活性的影響（， n=12）Tab.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability（， n=12）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃連解毒湯低劑量組比較，▲▲P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）存活率／%空白組 — 100.00±0.15模型組 — 45.51±3.87??多奈哌齊組 0.000 9 65.56±2.51△△黃連解毒湯低劑量組 2.7 49.36±3.95△黃連解毒湯高劑量組 8.1 67.53±4.62△△▲▲

圖1 黃連解毒湯對HT22 細胞活性的影響Fig.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability

3.2 黃連解毒湯對 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平的影響 表2顯示，與空白組相較，模型組SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連解毒湯組 SOD、GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.01），MDA 水平顯著降低（P＜0.01），以高劑量組更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。

3.3 黃連解毒湯對 Cyt C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達的影響 圖2～3顯示，與空白組比較，模型組Cyt C、Caspase-3 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），Bcl-2／Bax顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃連解毒湯組 Cyt C、Caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2／Bax顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯（P＜0.05）。

表2 黃連解毒湯對SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平的影響（， n=12）Tab.2 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on SOD，GSH-Px activities and MDA level（， n=12）

表2 黃連解毒湯對SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平的影響（， n=12）Tab.2 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on SOD，GSH-Px activities and MDA level（， n=12）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與黃連解毒湯低劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）SOD／（U·mL-1）GSH-Px／（U·mL-1）MDA／（nmol·mL-1）空白組 — 163.56±65.34 563.64±64.34 14.43±2.54模型組 — 88.32±55.64?? 332.64±97.24?? 35.32±3.43??多奈哌齊組 0.000 9 128.65±32.34△△ 502.76±75.28△△ 18.54±4.75△△黃連解毒湯低劑量組 2.7 103.64±65.65 355.96±54.43 27.54±3.64△△黃連解毒湯高劑量組 8.1 135.65±54.49△△▲ 512.64±33.96△△▲▲ 19.64±2.75△△▲▲

圖2 各組 Cyt C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達Fig.2 Cyt C，Bcl-2，Bax and Caspase-3 protein expressions in various groups

4 討論

在阿爾茨海默病的發生與進展中，神經元細胞凋亡參與其中［9-10］。Aβ 可通過改變凋亡相關基因Bcl-2 家族的表達來誘導細胞凋亡［11］，激活存活信號通路是保護 Aβ 誘導的的神經元凋亡途徑［12］。Bcl-2 家族成員中的Bcl-2、Bax 是線粒體膜滲透性的主要調節因子，前者是一種抗凋亡蛋白，可維持線粒體膜通透性，從而穩定線粒體完整性，減少細胞色素 C 釋放，抑制細胞凋亡［13］；后者是一種促凋亡蛋白，可影響線粒體膜滲透性，誘導細胞色素C 從線粒體膜間隙進入胞漿釋放，從而引起細胞凋亡［14-15］。另外，細胞色素 C 可通過激活 Caspase-9進而激活 Caspase-3，最終導致細胞凋亡［16-17］。

氧化應激是由于機體活性氧產生、抗氧化失衡所致，自由基生成過多或機體清除能力受限時，可引起脂質過氧化，使得神經元細胞受損。SOD 是一種抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子來保護組織免受損傷，間接反映了組織抗氧化能力；GSH-Px是一種催化過氧化氫分解的酶，可通過催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構、功能完整的作用；MDA 是一種脂質過氧化產物，可反映組織氧化程度，故三者可間接反應機體受自由基攻擊的嚴重程度及清除自由基的能力［18］。同時，氧化應激可作為各種形式的細胞死亡中一種常見的最終途徑，Aβ 引起阿爾茨海默病也與其有關，氧化應激產物對患者具有毒性作用，可通過激發氧自由基的產生，脂質過氧化，損傷神經元細胞，誘導凋亡相關基因的表達，最終激活Caspase，使神經元細胞大量凋亡流失［19］，并誘發該疾病。

圖3 黃連解毒湯對 Cyt C（A）、Bcl-2／Bax（B）、Caspase-3（C）蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on Cyt C（A ），Bcl-2／Bax（B ）and Caspase-3（C ）protein expressions

黃連解毒湯為清熱解毒的代表方劑，源于唐代王燾 《外臺秘要》，基于 “痰、瘀、火”為阿爾茨海默病的病機基礎，由清熱解毒藥材黃連、黃芩、黃柏、梔子組成。方青等［20］報道，黃連解毒湯可能通過干預Aβ 沉積對神經細胞的作用來顯著改善阿爾茨海默病動物模型的記憶障礙和學習能力；陳國華等［21］發現，黃連解毒湯可減少 APP ／PS1 雙轉基因AD 模型小鼠海馬CA1 區SP 數量和胞外誘捕網（NETs）形成，并降低 IL-6、IL-1β 水平，表明該方能保護神經細胞，減少老年斑生成，從而起到防治作用；柴山周乃等［22］臨床研究顯示，黃連解毒湯可增加阿爾茨海默病患者腦部血流量，對其認知功能有明顯的改善作用；付曉春等［23］指出，黃連解毒湯可抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經細胞凋亡，其作用機制是通過下調Caspase-3 表達來實現；龍建飛等［24］研究表明黃連解毒湯水提物可通過抑制 Caspase-3 活性，降低 PARP 過度表達，從而降低大鼠缺血半暗帶皮層NeuN 陽性細胞凋亡，保護缺血半暗帶神經元。

課題組前期發現，黃連解毒湯含藥血清可改善氧化應激對神經的毒性作用，從而改善SAM-P／8小鼠學習記憶能力［25］，為了進一步探究其神經保護作用，本實驗采用Aβ25-35建立阿爾茨海默病細胞模型，觀察其對Aβ25-35誘導HT22 細胞活性的影響。結果，Aβ25-35（40 μmol／L，24 h）誘導 HT22細胞阿爾茨海默病模型時，細胞活性明顯下降，提示造模成功；細胞上清液中SOD、GSH-Px 活性明顯降低，MDA 活性明顯升高，提示出現氧化應激；Bcl-2／Bax 比值明顯降低，Cyt C、Caspase-3 蛋白表達明顯升高，提示線粒體凋亡途徑被激活，而黃連解毒湯含藥血清可減輕Aβ25-35誘導的HT22 細胞氧化應激反應，逆轉 Bcl-2／Bax，抑制細胞色素 C 釋放，同時下調Caspase-3 蛋白表達，從而抑制細胞凋亡，對細胞神經毒性起到保護作用。因此，黃連解毒湯可能成為預防或治療阿爾茨海默病的潛在藥物，但由于該方所含藥材成分復雜，作用環節多，故對其作用機制的研究還需進一步深入。