左金丸活性成分-靶點-多維作用機制

李躍文，劉志強，易增興，秦后響，王博龍

（宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

左金丸始載于元代著名醫(yī)家朱震亨所撰 《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸用量按6 ∶1 比例組成，以水丸或湯劑入藥，具有清肝瀉火、降逆和胃、開郁散結等功效，臨床大多用于胃炎、食道炎、胃潰瘍等屬肝火犯胃者?，F(xiàn)代藥理研究［1-4］發(fā)現(xiàn)，左金丸中黃連、小檗堿可顯著誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的信號轉導；小檗堿起到質子泵抑制劑，即H＋／K＋-ATP 酶抑制劑的作用，從而抑制胃酸分泌；小檗堿、吳茱萸次堿直接拮抗膽堿受體或抑制膽堿酯酶的活性，具有抑制小鼠胃腸道蠕動的作用，還可抑制炎癥細胞因子的產生和分泌，從而發(fā)揮抗炎作用，故該制劑臨床應用也擴展到腫瘤、炎癥等疾病的治療［5］。然而，左金丸主要藥效成分、靶標、通路，以及治療不同疾病的分子機制迄今仍不清楚。

網絡藥理學是以系統(tǒng)生物學、多向藥理學為理論基礎，通過構建藥物-靶點-疾病之間的復雜網絡來探討藥物作用機制，其研究方法的整體性、系統(tǒng)性非常適合于研究多組分、多靶點的中藥及其復方，為挖掘中藥藥效物質及其作用機制，闡述復方配伍規(guī)律及一方多效提供了新的途徑與方法［6-8］，已成為中藥及其復方研究中的熱點［9］。本研究借助網絡藥理學方法，探索左金丸主要藥效物質基礎與靶標、疾病的相互作用關系，以期系統(tǒng)、全面地闡述其機制。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分收集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP 數據庫收集左金丸中黃連、吳茱萸的主要化學成分，以 OB ＞30%、DL ＞0.18作為其活性成分篩選條件。其中，口服生物利用度（OB）指的是藥物有效成分或活性基被吸收到達體循環(huán)并被吸收的速度與程度，類藥性（DL）指的是藥物包含一些特定功能基團或具有與大多藥物相同或相似的物理特征，兩者為中藥成分吸收、分布、代謝、排泄（ADME）的關鍵參數。同時結合文獻最終確定左金丸活性成分。

1.2 左金丸活性成分-靶點網絡構建及靶點-疾病網絡構建 TCMSP 數據庫提供了潛在活性分子的靶點（包括Drugbank 數據庫中6 511 個藥物分子、3 987 個與已知化合物相互作用的蛋白質），通過該數據庫提取活性成分的作用靶蛋白，UniProt、GeneCards 數據庫篩選出物種為 “人”的對應靶基因，從而獲得其活性成分的對應靶基因。然后，運用Cytoscape 軟件將TCMSP 數據庫篩選出的左金丸活性成分與其潛在靶點構建 “左金丸活性成分-靶點”網絡圖，“Network Analyzer”插件分析該網絡圖的拓撲屬性，依據其 “節(jié)點度值分布、介數中心性”2 個重要網絡拓撲參數來篩選左金丸主要活性成分。

1.3 左金丸靶點-疾病網絡構建 通過TTD 數據庫找尋左金丸靶點潛在治療疾病，Cytoscape 軟件構建左金丸靶點-疾病網絡圖。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡構建 將左金丸靶蛋白導入 STRING 數據庫，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”后進行操作，最低相互作用閥值設為中等 “medium confidence”，其余參數均保持默認，構建左金丸靶蛋白之間的相互作用網絡（PPI network），結果保存成TSV 格式并導入 Cytoscape，再利用 “Network Analysis”功能進行網絡的拓撲屬性分析，將度值、介數均排序在前20 的靶蛋白建立交集，篩選左金丸關鍵靶蛋白。

1.5 GO 生物過程與KEGG 通路富集 利用Cytoscape 軟件中的 “BiNGO”插件對左金丸靶基因進行GO 生物過程富集，并應用 “MCODE”插件對所有具有統(tǒng)計學意義（P-value＜0.05）的 GO 生物過程進行聚類分析，并對各子簇進行注釋；利用DAVID6.8 平臺對左金丸進行KEGG 通路富集，設定閾值P-value＜0.05，研究相關靶點參與的主要信號通路。

2 結果

2.1 活性成分篩選 依據DL＞0.18、OB＞30%的原則，在TCMSP 數據庫中篩選出11種活性成分，另外黃連中藥根堿、非洲防己堿OB 值雖然相對較低，但文獻［5，10-11］報道兩者也是該藥材活性物質，最終篩選出 13種，見表1。

表1 左金丸中活性成分Tab.1 Active ingredients in Zuojin Pills

2.2 活性成分-靶點分析 以左金丸中13種活性成分和49 個靶點構建活性成分-靶點網絡圖（圖1），各節(jié)點度值、介數中心性分布見圖2～3，可知兩者平均值分別為6、0.02。由圖1 可知，吳茱萸次堿、藥根堿、吳茱萸堿、非洲防己堿、小檗堿、巴馬汀6種成分的度值、介數均超過了平均值，可能是左金丸中活性成分，見表2。

圖1 左金丸活性成分-靶點網絡Fig.1 Active ingredients-targets network of Zuojin Pills

圖2 度值分布（Ⅰ）Fig.2 Degree value distribution（Ⅰ）

2.3 靶點-疾病網絡分析 以左金丸具有疾病治療作用的32 個靶點構建靶點-疾病網絡圖（圖4），可知在消化、神經、心血管系統(tǒng)疾病，以及炎癥、癌癥等方面具有治療價值，呈現(xiàn)出多維藥理作用。

圖3 介數中心性分布（Ⅰ）Fig.3 Betweenness centrality distribution（Ⅰ）

2.4 靶點PPI 網絡分析 將左金丸49 個靶蛋白在STRING 平臺進行PPI 網絡分析，發(fā)現(xiàn)有47 個節(jié)點蛋白（2 個靶蛋白未參與蛋白互作），207 條相互作用連線，其度值、介數中心性分布見圖5～7。再將兩者均排序在前20 的靶蛋白建立交集，篩選出度值高、介數大者有 15 個，見表3，可知它們是PPI 網絡中的關鍵節(jié)點，即為左金丸發(fā)揮藥理作用的關鍵靶點。

圖4 左金丸靶點-疾病網絡Fig.4 Targets-diseases network of Zuojin Pills

表2 活性成分拓撲參數Tab.2 Topological parameters for active ingredients

2.5 GO 生物過程富集 應用 “BiNGO”插件對49 個靶點進行GO 生物過程富集，最終得到P＜0.05 的 GO 條目 1 092 個，再通過 “MCODE”插件進行聚類分析，結果見表4，共發(fā)現(xiàn)炎癥反應調節(jié)、一氧化氮生物合成與代謝、突觸傳遞、細胞周期與分化、前列腺素合成與代謝等19 個主要子簇。

圖5 靶蛋白PPI 網絡Fig.5 PPI network of target proteins

2.6 KEGG 信號通路分析 將左金丸49 個靶基因在KEGG 信號通路富集，以P＜0.05 為標準篩選，得到22 條主要信號通路，包括3 條消化液分泌相關通路，消化液分泌、胃酸分泌、胰腺分泌；5 條癌癥相關通路，癌癥通路、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌；2 條內分泌通路，雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路；3 條神經遞質相關通路，5-羥色胺能神經突觸、神經活性配體受體相互作用信號通路、膽堿能突觸；1 條炎癥通路，腫瘤壞死因子信號通路；4 條信號轉導通路，PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路、鈣信號通路、T 細胞受體信號通路；4 條心血管通路：心肌細胞腎上腺素能信號、血管平滑肌收縮、血管內皮生長因子信號通路、血小板激活。見表5、圖8。

圖6 度值分布（Ⅱ）Fig.6 Degree value distribution（Ⅱ）

圖7 介數中心性分布（Ⅱ）Fig.7 Betweenness centrality distribution（Ⅱ）

表3 關鍵靶點與拓撲參數Tab.3 Key targets and topological parameters

表4 子簇注釋及中心GO 條目Tab.4 Sub-cluster comments and central GO entries

續(xù)表4

續(xù)表4

表5 KEGG 信號通路Tab.5 KEGG signaling pathways

圖8 KEGG 信號通路富集Fig.8 Enrichment of KEGG signaling pathways

3 討論

本研究利用TCMSP 數據庫篩選得到左金丸13個活性成分及49 個對應靶點，并構建左金丸活性成分-靶點、靶點-疾病、PPI 網絡，發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿、藥根堿、吳茱萸堿、非洲防己堿、小檗堿、巴馬汀 6種成分，以及 ESR1、TNF、AR、NOS3、PTGS2、CDK2、MMP9、MMP2、NOS2、IL4 等 15個靶點的度值、介值均較靠前，可能是左金丸主要藥效物質及其關鍵作用靶點。左金丸中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿、表小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等生物堿具有減少胃酸分泌、促進潰瘍愈合的作用［12］，與本研究預測得到的主要藥效物質，以及疏肝瀉火、和胃止痛的功效主治基本一致，其中吳茱萸次堿不僅能抗膽堿能神經，抑制胃腸道運動亢進，還可抑制環(huán)氧合酶2（COX-2）的活性或花生四烯酸釋放，減少炎性介質前列腺素 E（PGE）的合成而抗炎［13］；吳茱萸堿可通過抑制 NF-κB（p65）蛋白表達，降低 TNF-α 水平，從而發(fā)揮腸黏膜保護作用［14］；小檗堿則可顯著抑制 IL-6、TNF-α 分泌，減輕由內脂素誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷，并改善肥胖小鼠胰島素抵抗和糖代謝異常［15-16］。周祥羽等［17］發(fā)現(xiàn)，左金丸能顯著升高胃熱證大鼠血清中IL-10、B 細胞淋巴瘤因子 2（Bcl-2）水平，降低 IL-2、IL-6、IL-1β、NO 水平，從而減少胃熱證大鼠胃黏膜損傷面積；易文等［18］報道，左金丸可通過抑制肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎患者分泌 NOS2、NO、TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促進其分泌 IL-4、IL-10 等抗炎因子，從而恢復促炎因子和抗炎因子之間的平衡，與本研究中GO 生物過程、KEGG 信號通路富集顯示左金丸參與NO 生物合成和炎癥反應的調節(jié)相吻合；尹抗抗等［19］指出，左金丸能明顯抑制胃酸分泌，提高胃液pH 值，降低胃潰瘍指數，從而抑制大鼠應激性胃潰瘍的發(fā)生；林科名等［20］研究表明，左金丸乙醇提取物還能降低應激性胃潰瘍大鼠腦組織中去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺及腎上腺組織中NE 等單胺神經遞質濃度，通過神經體液途徑發(fā)揮抗應激性胃潰瘍的作用；本研究中KEGG 信號通路富集顯示左金丸不僅作用于胃酸分泌、胰腺分泌、消化液分泌信號通路，影響整個消化道腺體分泌，還參與5-羥色胺能神經突觸、膽堿能神經突觸、神經活性配體受體相互作用信號通路等神經遞質、胃腸道遞質信號通路，這可能是其抑制胃酸、胰液等消化液分泌，促進潰瘍愈合，調節(jié)胃腸蠕動，治療中醫(yī)之脘脅疼痛，口苦嘈雜，嘔吐酸水的肝火犯胃證，以及西醫(yī)多種胃炎、膽囊炎、消化性潰瘍、功能性消化不良等［21-22］胃腸疾病的藥理基礎。

左金丸靶點KEGG 富集集中的另一個領域是癌癥，主要有癌癥通路、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌5 條，表明它在癌癥治療方面具有潛在價值。目前已確認的抗癌活性成分有小檗堿和吳茱萸堿［10］，其中前者不僅抑制 EGFR、ERBB2、FGFR1、MET、VEGFR2 等多個酪氨酸激酶受體激活，誘導癌細胞凋亡或周期停滯，抑制癌細胞生長及轉移，增強腫瘤細胞化療敏感性，還能調控 P13 K／AKT 通路，抑制 MMP2、MMP9 表達，有效降低肺腺癌細胞A549 細胞、膀胱癌T24 細胞的遷移侵襲能力，從而產生腫瘤防治作用［23-27］；后者可通過調節(jié)M 期阻滯與滑移，上調a-SMase 表達，誘導人胃 癌 SGC-7901 細胞凋亡［28］。杜 佳等［29］發(fā)現(xiàn)，左金丸含藥血清可通過調節(jié)乳腺癌細胞 CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyciln E 等周期相關蛋白，阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，進而抑制乳腺癌細胞增殖，與本研究中左金丸GO 富集得到細胞周期、細胞凋亡等生物子簇相吻合。

另外還發(fā)現(xiàn)，左金丸能作用于心肌細胞腎上腺素能信號、血管內皮生長因子、血小板激活等心血管相關信號通路，表明其具有治療心血管疾病的潛在價值。林晶晶等［30］報道，吳茱萸堿、吳茱萸次堿具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、調節(jié)血壓、保護心臟等心血管藥理作用；小檗堿不僅能抑制血小板聚集，減少血液黏稠度，抑制血栓形成，預防心腦血管疾病，還可減少心肌細胞膜上的α 腎上腺素受體數，抑制心肌細胞鈣內流，阻斷細胞凋亡，從而保護心肌細胞［31-33］。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法研究左金丸，闡述了其治療消化系統(tǒng)疾病、癌癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病的活性成分、靶點、多維作用機制，為今后相關研究提供思路與線索，也為拓展該制劑臨床應用奠定理論依據。