彌羅松酚在大鼠腦核團內的分布

邵敏芳，曹桂云，范 瑛?

（1.蘇州大學附屬第二醫院，江蘇 蘇州 215000；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000）

彌羅松酚是從唇形科（如丹參、絨毛栗色鼠尾草、輪葉婆婆納、淡黃香茶菜）或松柏綱（如日本雪松、羅漢松、香榧、側柏葉）植物中分離得到的松香烷型三環二萜類化合物，具有多種生物活性，如抗菌［1］、抗氧化［2］、抗癌［3］、抗瘧［4］、保肝［5］、胃腸保護作用［6］，課題組前期研究表明靜脈給藥后該成分可快速進入腦組織進行分布，具有抗帕金森活性，但在腦核團內分布的動力學變化尚不明確，這對治療腦部疾病具有重要的意義。因此，本實驗對彌羅松酚的腦核團分布進行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配置手動進樣器、四元梯度泵、DAD 檢測器；MIKRO 22R 臺式冷凍離心機（德國Hettich 公司）；FSH 勻漿機（常州恒隆儀器有限公司）。

1.2 試藥 彌羅松酚由本實驗室從絨毛栗色鼠尾草中分離得到，其結構經 HPLC、MS 法確認，含有量＞98%。乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 動物 雄性 Wistar 大鼠，體質量 230～250 g，購自揚州大學比較醫學中心，動物生產許可證號SYXK（蘇）2012-0029，置于（22±1）℃控溫、光暗周期12 h 環境下，清潔級普通大鼠飼料飼養。實驗前12 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取彌羅松酚對照品2.00 mg，甲醇制成 1.0 mg／mL 貯備液，再稀釋成系列質量濃度，即得，密封，置于 4 ℃ 冰箱中備用。

2.2 分組、給藥及采樣 60 只大鼠隨機分為6組，其中 1 組為空白組，另外 5 組為給藥組，按40 mg／kg 劑量尾靜脈注射給藥（溶于蓖麻油-乙醇-水溶液中，比例為 4 ∶10 ∶86），空白組給予相同劑量蓖麻油-乙醇-水溶液。各組于給藥 8、23、45、60、70 min 后處死大鼠，冰盒上迅速取腦并分離海馬、紋狀體、丘腦、下丘腦、大腦皮層、小腦，-20 ℃下冷凍備用。

2.3 樣品預處理 精密稱取各腦核團組織，加入2 倍量生理鹽水勻漿，勻漿液加入2 倍量乙酸乙酯后渦旋混合 1 min，4 ℃、8 000×g下離心 10 min，取上清液，重復操作 2 次，合并有機相，45 ℃下N2吹干，殘渣溶于 100 μL 甲醇中，0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.4 色譜條件 YMC ODS C18色譜柱；流動相乙腈-水（85 ∶15）；體積流量 0.8 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長 220 nm；進樣量 20 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察和專屬性試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，精密配制系列標準曲線，每條設 6 個質量濃度點，按“2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。以彌羅松酚質量濃度為橫坐標（X），其峰面積為縱坐標（Y），加權最小二乘法進行回歸，權重系數為1／x2，以相關系數r來評價相關性。

2.5.2 最低檢測限（LLOD）、最低定量限（LLOQ）測定 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成標準曲線末端質量濃度，并逐漸降低，分別以檢測成分信號與噪音信號比 3 ∶1、10 ∶1 時的質量濃度為 LLOD、LLOQ。

2.5.3 準確度、精密度試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低 3 個質量濃度，平行 3 份，按 “2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定，每個質量濃度同1 d 內連續進樣3 次測定峰面積，計算平均值和日內精密度；每個樣品連續3 d 各進樣1 次測定峰面積，計算平均值和日間精密度。

2.5.4 萃取回收率試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低3 個質量濃度，平行 3 份，按 “2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。

2.5.5 穩定性試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低3 個質量濃度，平行3 份，將組織液置于-20 ℃冰箱中冷凍 24 h 后室溫下放置 1 h 解凍，重復 3 次，按“2.3”項下方法處理后，在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。

3 結果

3.1 彌羅松酚波譜數據 白色固體，ESI-MSm／z：287.2［M ＋H］＋，分子式 C20H30O。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.83（1H，s，H-14），6.61（1H，s，H-11），3.14（1H，sept，J= 6.6 Hz，H-15），2.84（1H，m，H-7β），2.77（1H，m，H-7α），2.09（1H，m），1.84（1H，m），1.67（2H，m），1.56（1H，m），1.46（1H，m），1.32（2H，m），1.23（3H，d，J=6.6 Hz，17-CH3），1.22（3H，d，J=6.6 Hz，16-CH3），1.14（3H，s，20-CH3），0.94（3H，s，19-CH3），0.91（3H，s，18-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：150.7（C-12），148.7（C-9），131.6（C-13），127.3（C-8），126.4（C-14），111.1（C-11），50.4（C-5），41.8（C-3），38.9（C-1），37.5（C-10），33.5（C-4），33.4（C-18），29.8（C-7），26.8（C-15），24.8（C-20），22.9（C-17），22.7（C-16），21.7（C-19），19.4（C-2），19.3（C-6）。以上數據與文獻［7］報道基本一致，故鑒定為彌羅松酚。

3.2 方法學考察

3.2.1 專屬性試驗 圖1顯示，在 “2.4”項色譜條件下彌羅松酚保留時間為11.4 min，內源性物質對其無干擾，方法專屬性良好。

圖1 彌羅松酚HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ferruginol

3.2.2 線性關系考察 表1顯示，各腦核團在各自范圍內呈良好的線性關系（r＞0.990 0）。

表1 彌羅松酚線性關系Tab.1 Linear relationships of ferruginol

3.2.3 LLOD、LLOQ 測定 兩者分別為 0.02、0.06 μg／mL。

3.2.4 準確度、精密度試驗 表2顯示，彌羅松酚在各腦核團中的日內、日間精密度RSD 均小于15%，日間、日內準確度分別為98.26%～108.43%、97.38%～110.22%，表明該方法精密度、準確度良好。

3.2.5 萃取回收率 表2顯示，彌羅松酚在大鼠腦核團中的萃取回收率在75%以上，符合生物樣品檢測相關要求。

3.2.6 穩定性試驗 表2顯示，彌羅松酚準確度在91.37%～103.74% 之間，具有良好的凍融穩定性。

3.3 腦核團分布 大鼠尾靜脈注射給予40 mg／kg彌羅松酚，于給藥 8、23、45、60、70 min 后分別取海馬、大腦皮層、丘腦、紋狀體、下丘腦、小腦6 個腦核團，HPLC 法測定各腦核團中彌羅松酚含有量，結果見圖2。由圖可知，靜脈注射給藥后彌羅松酚可透過血腦屏障，在腦核團內形成持續的分布過程；給藥后45 min 左右，大鼠腦核團內該成分含有量達到峰值，之后很快下降，峰值濃度依次為紋狀體＞丘腦＞海馬＞大腦皮層＞小腦＞下丘腦，達峰時間差異較小，僅從23 min 到45 min。

表2 彌羅松酚精密度、準確度、萃取回收率、穩定性試驗結果（n=3）Tab.2 Results of precision，accuracy，extraction recovery and stability tests for ferruginol（n=3）

圖2 彌羅松酚在腦核團中的峰值濃度Fig.2 Peak concentrations of ferruginol in cerebral nuclei

4 討論

每個腦核團在腦功能中的作用不同，例如海馬體主要負責學習、記憶、空間定位，日常生活中的短期記憶都儲存在其中［8-9］；大腦皮質是調節或控制軀體運動的最高級中樞［10］；丘腦具有轉運站的功能，從脊髓傳來的神經沖動都先中止于丘腦，然后再分別傳送至大腦皮質相關區域［11］，其受損將導致感覺扭曲，從而無法正確了解周圍世界；下丘腦為內分泌、神經系統的中心，能調節垂體前葉功能，合成神經垂體激素，控制自主神經和植物神經功能［12］；紋狀體與隨意運動的穩定、肌張力的維持、肢體姿勢的調節活動有關，此外還與對本體感受器傳入的信息處理，即與無意識的運動反射控制有一定聯系［13-14］，根據臨床、病理學觀察，紋狀體不同部位的損害可產生帕金森病［15-16］、舞蹈病、手足徐動癥等［17-19］，故動態觀察藥物在腦內不同核團內的分布對探討其對腦功能的影響有著重要意義，也可指導相應藥物開發。

本實驗發現，彌羅松酚靜脈注射后在海馬、大腦皮層、丘腦、紋狀體、下丘腦、小腦中均有分布，其中在紋狀體、丘腦中有富集傾向。該成分對治療腦部疾病可能有一定的作用，但對大腦的影響較復雜，提示在設計中樞治療藥物時要充分考慮具體腦核團分布規律，從而得到較好的藥效和較低的副作用。