HPLC法同時測定款冬花中7種成分

吳 笛，雷 昌，唐 林

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具潤肺下氣、止咳化痰之功效，為常用中藥材，臨床多用其蜜炙品（蜜款冬花）。課題組前期已對其化學成分進行了系統的植化分離，從中分離得到款冬酮［1］及多種黃酮類、咖啡酰基奎寧酸類化合物［2］。臨床上，細菌、病毒感染呼吸道引起的炎癥如氣管炎、咽喉炎、肺炎等是導致咳嗽的主要原因之一。黃酮類、咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂锌咕⒖寡鬃饔茫?-8］，可能與款冬花鎮咳功效相關。有文獻［9］證實從款冬花中分離得到的綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩幔ó惥G原酸A）、3，4-二咖啡?；鼘幩幔ó惥G原酸B）、4，5-二咖啡?；鼘幩幔ó惥G原酸C）均具有顯著的鎮咳、祛痰、抗炎作用。

2015年版 《中國藥典》 一部款冬花項下的含有量測定僅檢測款冬酮1種成分，不能全面反映款冬花的質量。文獻［10］采用 HPLC 法同時測定款冬花中9種成分的含有量，文獻［11］采用一測多評技術同時測定款冬花中10種成分的含有量，兩者檢測的指標成分雖多，但選擇的指標成分并不全面，且部分為含有量較低的非主要成分，部分為非藥效相關成分，部分為罕見成分（對照品難得，定量分析難以普及）。本研究擬建立HPLC 法同時測定款冬花中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸 A、異綠原酸 C、款冬酮的含有量，以期為款冬花的質量評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括 G1311C 四元泵、G1329B 自動進樣器、G1330B 自動進樣器控溫模塊、G1316 A柱溫箱、G1315D DAD 檢測器；ELGA LA612 型超純水機（英國Elga 公司）；SK7200HP 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；Mettler Toledo AL204 型分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；Sartorius BP211D 型分析天平（十萬分之一，德國 Sartorius 公司）；Mettler Toledo FE-20型酸度計（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 材料 款冬花藥材采集于國內各主要產區，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院吳笛博士鑒定均為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾。蜜款冬花的制備按照2015年版 《中國藥典》 一部款冬花項下蜜款冬花的要求及四部規定的蜜炙法進行［12-13］。藥材和蜜炙品經 60 ℃干燥后，粉碎成細粉（過3 號篩）。

對照品綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸C、款冬酮均為自制，異綠原酸 A 購于成都普菲德生物技術有限公司，經HPLC 檢測，含有量均大于98%；甲醇、乙腈均為色譜純，購于美國Tedia 公司；磷酸為色譜純，購于天津市光復精細化工研究所；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 依利特 Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相 A，乙腈為流動相B，0.1%磷酸溶液為流動相C，梯度洗脫程序見表1；檢測波長220 nm；柱溫25 ℃；體積流量 1 mL／min；進樣量 10 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質量的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 各 含 100、50、10、100、100、100、10 μg 的溶液，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供試品溶液制備 取款冬花粉末（過3 號篩）0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇45 mL，超聲處理（功率350 W，頻率53 kHz）60 min，取出，放冷，用 70% 甲醇補足減失質量，過濾，取續濾液用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關系考察、最低檢測限（LOD）和最低定量限（LOQ）取干燥至恒定質量的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 各含約1 mg 的混合溶液，作為貯備液。取貯備 液，稀 釋 至 約 500、100、50、10、5、1、0.5 μg／mL，在 “2.1”項色譜條件下進樣。以對照品質量濃度為橫坐標（X），相應峰面積為縱坐標（Y）進行回歸。逐步稀釋對照品溶液，按信噪比3 和10 分別計算各成分的最低檢測限（LOD）和最低定量限（LOQ）。結果見表2。

2.5 精密度試驗

2.5.1 日內精密度 以對照品溶液連續進樣5 次，得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸 C、款冬酮峰面積的 RSD 分別為0.8% 、0.2% 、0.9% 、0.6% 、0.5% 、0.7% 、0.4%，表明日內精密度良好。

2.5.2 日間精密度 以對照品溶液連續進樣5 d，1 次／d，得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸 B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮峰面積的RSD 分別為1.8%、0.9%、1.1%、1.3%、1.6%、1.4%、0.7%，表明日間精密度良好。

表2 各成分線性關系、最低檢測限和最低定量限Tab.2 Linear relationships，limit of detection（LOD）and limit of quantity（LOQ）of various constituents

2.6 重復性試驗 取同一樣品（編號13），見表3，6 份，每份稱取 0.3 g，精密稱定，按 “2.3”項下的方法平行制備供試品溶液，進樣測定，得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸 B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮含有量RSD 分別為2.0%、1.6% 、1.3% 、2.4% 、2.8% 、2.5% 、1.7% ，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取 “2.6”項下同一供試品，于 0、6、12、24、48、72 h 連續進樣 6 次，記錄72 h 內峰面積，得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮峰面積 RSD 分 別 為 1.2%、0.8%、1.5%、1.7%、1.6% 、1.9% 、0.7% 。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批次樣品（編號13）約 0.15 g，精密稱定，精密加入高、中、低3 個劑量的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮對照品，共9 份，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣。測得綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮的加樣回收率分別為99.5%（RSD 2.1%）、101.1%（RSD 2.5%）、100.8%（RSD 1.8%）、99.3%（RSD 2.0% ）、102.2%（RSD 2.3%）、99.0%（RSD 2.6%）、101.9%（RSD 2.8%）。

2.9 樣品含有量測定 取款冬花藥材和蜜炙品（蜜炙品的取樣量折算成對應的藥材的量），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣，計算綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮的含有量。結果見表3。

表3 各成分含有量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 討論

3.1 定量分析指標成分選擇 對款冬花不同濃度甲醇提取液分別進行HPLC 分析，顯示主要成分為綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、款冬酮。蘆丁、異槲皮苷為黃酮類化合物，具抗菌、抗炎活性［3-5］，可能與款冬花鎮咳功效相關；綠原酸、異綠原酸 B、異綠原酸A、異綠原酸C 為咖啡酰基奎寧酸類化合物，已被證實具有顯著的鎮咳、祛痰、抗炎作用［9］；款冬酮為2015年版 《中國藥典》 規定的款冬花的質量控制指標成分。綜上，選擇此7種成分作為款冬花定量分析的指標成分。

3.2 色譜條件優化 款冬酮的最大紫外吸收波長為220 nm，220～250 nm 波段紫外吸收急劇降低，250 nm 以上波段紫外吸收極弱。綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的紫外吸收相似，蘆丁、異槲皮苷的紫外吸收相似，此6種成分在220 nm 處均有較強紫外吸收。綜合考慮三類成分的紫外吸收特征，選擇220 nm 為檢測波長。

對流動相進行了重點考察，咖啡?；鼘幩犷惓煞趾忘S酮類成分在甲醇-水、乙腈-水系統中均出現嚴重的拖尾現象，故在水相中加入一定量的酸以改善峰形。經比較，甲酸、冰醋酸、磷酸對峰形的改善效果基本一致，但甲酸、冰醋酸在220 nm 波長下均有一定的紫外吸收，用于梯度洗脫時基線向上嚴重漂移，故選擇在水相中加入0.1% 的磷酸（220 nm 波長下無紫外吸收，用于梯度洗脫時基線僅有輕微漂移）。

對于極性較大的咖啡?；鼘幩犷惓煞趾忘S酮類成分，乙腈-0.1%磷酸系統的分離效果較好，而甲醇-0.1%磷酸系統的分離效果較差。與之相反，極性較小的款冬酮在甲醇-0.1%磷酸系統中分離較好，但在乙腈-0.1%磷酸系統中分離較差。在單一的甲醇-0.1% 磷酸系統或乙腈-0.1% 磷酸系統中，三類成分難以同時得到良好的分離。為兼顧各指標成分的分離效果，采用了甲醇-乙腈-0.1% 磷酸混合系統，經不斷優化洗脫條件，各指標成分最終得到良好分離。

3.3 樣品處理方法優化 考察了不同溶劑及不同提取方法對各指標成分提取效率的影響，結果顯示70%甲醇對各指標成分的提取效率最高；超聲處理60 min 對各指標成分的提取效率顯著優于靜置12 h及超聲處理15、30、45 min。因咖啡?；鼘幩犷惢衔镉鰺岵环€定，特別是在溶液狀態下穩定性較差，故未考察加熱回流提取方法。

3.4 咖啡?；鼘幩犷惓煞址€定性 綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 屬咖啡?；鼘幩犷惢衔铮@是一類由奎寧酸與數目不等的咖啡酸通過酯鍵連接而成的酚酸類化合物，具有酯鍵和多酚羥基的結構。酯鍵結構具有水解性，在堿性條件下易發生水解反應。多酚羥基結構具有還原性，易受空氣中的氧、溫度和光照的影響，易被氧化。實驗顯示在室內溫度25～35 ℃、不避光及溶液狀態下，綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的穩定性較差，24 h 內相應峰面積即顯著變小，但在低溫（2～5 ℃）、避光條件下，這些化合物在對照品溶液中至少5 d 內保持穩定，在樣品溶液中至少72 h 內保持穩定。

3.5 含有量測定結果 14 批款冬花樣品（包括8個藥材及6 個蜜炙品）的含有量測定結果顯示，不同產地的款冬花藥材中各指標成分的含有量差別較大，可能與其不同的生長環境有關；蜜炙品中綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量較對應的藥材有明顯降低的趨勢，可能與此類成分在蜜炙過程中受熱分解、被空氣氧化有關；款冬酮的含有量較對應的藥材有所升高，具體原因有待深入研究；蘆丁、異槲皮苷含有量變化的趨勢不明顯。