HPLC法測定西紅花不同部位中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ

王萌萌，徐步斌?，周 斌?，何天承

（1.江西科技師范大學藥學院，江西 南昌 330013；2.貴溪市藏紅花農林綜合開發有限公司，江西 貴溪 335400）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL.的干燥柱頭，又稱番紅花、泊夫蘭［1］。西紅花原產于西班牙、印度、希臘等地，目前在我國的西藏、河南、上海、江蘇［2-3］等地已有種植。西紅花的主要藥用部位是柱頭，但因其產量低且資源稀少，往往滿足不了大眾的需求［4-5］。西紅花性味甘平，具有活血化瘀、涼血解毒、安神的功效，中醫經常用于閉經、產后瘀阻、憂郁、驚悸等［6-8］。西紅花中主要成分有黃酮、苷類及揮發油類等，而西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ［9］是其主要有效成分。在藥理學方面，西紅花對心血管系統、動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病、抗腫瘤等［10-14］都有良好的治療作用。本實驗采用HPLC 法測定了江西產西紅花柱頭、雄蕊、花瓣、莖、球體中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量，并對其進行了比較，以期為進一步綜合開發利用西紅花資源提供參考，也為深入研究其質量奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；KQ-200VDE 型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP225D 電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 試藥 西紅花苷-Ⅰ對照品（批號 B21337，含有量 ≥ 98%）、西紅花苷-Ⅱ 對照品（批號B21338crocin-Ⅱ，含有量≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇為色譜純，乙醇為分析純（西隴化工股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

西紅花的各個部位分別為柱頭、雄蕊、花瓣、開花前和開花后的莖、球莖采自江西省貴溪市金屯鄉，經江西中醫藥大學鄧可眾副教授鑒定為正品。將不同部位的藥材分別于50 ℃條件下干燥3 h備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 依利特 hypersil ODS2 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（50 ∶50）；檢測波長 440 nm；體積流量 1.0 mL／min；進樣量20 μL；柱溫 25 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱定西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ對照品各 12.5 mg 置 25 mL 量瓶中，加50%乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ對照品貯備液，質量濃度為0.5 mg／mL。

2.3 供試品溶液制備 取適量干燥的西紅花花瓣、雄蕊、柱頭、開花前的莖和開花后的莖、球莖等樣品于研缽中研成細粉，分別稱取各樣品（柱頭除外）0.5 g，精密稱定，置于 10 mL 錐形瓶中，精密加入10 mL 50%乙醇，稱定質量。取柱頭樣品粉末 20 mg，精密稱定，置于 100 mL 錐形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，稱定質量，各樣品分別于室溫條件下超聲（200 W，40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，再稱定質量，用50% 乙醇補足減失質量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察 分別移取上述西紅花苷混合對照品溶液 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于5 mL 棕色量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，在 “2.1”項色譜條件下測定峰面積。以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。得回歸方程分別為Y= 127.28X- 78.649（R2=0.999 9）、Y= 135.46X-67.573（R2= 0.999 9），分別在 1.406～50.48、1.044～30.65 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取 “2.2”項下混合對照品溶液20 μL，在 “2.1”項色譜條件下連續進樣6 次。測得西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的峰面積RSD 分別為0.76%、0.90%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取西紅花柱頭粉末5 份，每份 20 mg，精密稱定，按 “2.3”項下方法平行制備5 份供試品溶液，經過0.22 μm 微孔濾膜過濾后，在 “2.1”項色譜條件下進樣 20 μL，測得西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量 RSD 分別為 0.77%、0.90%，RSD 值均小于2%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一批供試樣品溶液適量，分別于 0、2、6、8、12、24 h 在 “2.1”項色譜條件下進樣20 μL，測得西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ峰面積RSD 分別為1.60%、0.77%，表明該供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含有量的西紅花柱頭5 份，各10 mg，精密稱定。分別精密加入西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ對照品溶液（500 μg／mL）2.4、1.2 mL，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”色譜條件下進樣 20 μL，計算其加樣回收率，結果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結果（n=5）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents（ n=5）

2.9 樣品含有量測定 精密稱取3 份西紅花柱頭20 mg，花瓣、雄蕊、球莖、開花前的莖和開花后的莖等樣品粉末，平行 3 份，每份0.5 g，精密稱定，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進樣 20 μL，結果見表2。

3 討論

本實驗采用HPLC 法比較了西紅花不同部位中西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ的含有量，結果表明，西紅花柱頭中的含有量最高，總含有量為18.36%，符合2015版 《中國藥典》 的規定，西紅花中不同部位含有量高低的順序為柱頭＞雄蕊＞花瓣＞開花后的莖，而開花前的莖和球莖并未檢測出。

表2 各成分含有量測定結果（%）Tab.2 Results of content determination of various constituents（% ）

在進行色譜條件優化時，按2015版 《中國藥典》 中的色譜條件進行，由于出峰時間太長且峰形不美觀，經過調整，確定甲醇-水（50 ∶50）的比例，縮短了出峰時間，且可以達到基線分離。

西紅花苷是西紅花中的主要活性成分之一，具有重要的藥理作用。本實驗采用HPLC 法對西紅花中不同部位中的西紅花苷-Ⅰ和苷-Ⅱ含有量進行測定和比較，可以為其非傳統藥用部位或新藥藥用部位的開發利用提供實驗支持，也為其各部位的質量控制評價奠定基礎。