HPLC法同時測定不同產(chǎn)地龍膽酒炙前后3種環(huán)烯醚萜苷

呂 新，孫建之，徐士釗，才 謙?，曹麗娟，姜恒麗

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.盛實百草藥業(yè)有限公司，天津 300301）

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽Gentiana scabraBge.、三花龍膽Gentiana trifloraPall.或堅龍膽Gentiana rigescensFranch.的干燥根及根莖。前3種習(xí)稱龍膽，后 1種習(xí)稱堅龍膽［1］。龍膽的生長范圍廣泛，遍布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、浙江、江蘇、廣東、云南、新疆等地。其主要成分為環(huán)烯醚萜苷類，以含有量較高的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷為代表［2-7］。歷史上記載龍膽的炮制方法有很多，如酒龍膽、龍膽炭、膽汁制龍膽、蜜龍膽、姜龍膽等［8-10］，目前廣泛應(yīng)用的是生龍膽和酒龍膽。藥材經(jīng)過酒制后，發(fā)生了物理和化學(xué)變化，會導(dǎo)致藥性緩和或改變［11-13］。傳統(tǒng)理論認(rèn)為酒炙以熱制寒，可緩和生龍膽苦寒之性及引藥上行［14］。采用HPLC 法對22 個不同產(chǎn)地的生龍膽和對應(yīng)的自制酒龍膽中3種成分進(jìn)行含有量測定，并比較酒炙前后含有量差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀Angilent1100、SPD-l0A 紫外檢測器（美國安捷倫公司）；GTSONICP13 型超聲波清洗器（江蘇蘇州江東精密儀器有限公司）；CP225D 型電子天平（十萬分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 材料 龍膽飲片收集于不同產(chǎn)地，見表1，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李峰教授進(jìn)行鑒定為正品；酒龍膽為自制（方法參考2015年版 《中國藥典》Ⅰ附錄ⅡD 酒炙法）。黃酒（浙江塔牌紹興酒有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號GB／T17946）。龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷對照品均購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，含有量均≥98%；甲醇（色譜級，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸收波長確定 將藥材提取液進(jìn)行紫外全波長掃描，龍膽苦苷在270 nm 處有明顯吸收峰，而獐牙菜苦苷和獐芽菜苷較差；在240 nm 處3種成分都有明顯吸收，故檢測波長為240 nm。

2.2 色譜條件 Welchrom C18柱（4.6 nm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～25 min，8%～45%A；25～35 min，45%～48%A；35～45 min，48%～65%A；45～50 min，65%～90%A）；檢測波長240 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取適量的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷對照品，放置在10 mL量瓶中并加甲醇至刻度處，制得3種成分混合對照品溶液。質(zhì)量濃度分別為 2、0.2、16 μg／mL。

2.4 供試品溶液制備 將22 批不同產(chǎn)地的生、酒龍膽粉末過60 目篩，分別取0.5 g，精密稱定，加入甲醇 20 mL，記錄質(zhì)量，放入超聲儀器中，30 min后放冷再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，過濾定容至 25 mL 量瓶中，濾液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，避光，置于冰箱中4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗 取遼寧清原生、酒龍膽制備的供試品溶液和混合對照品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，見圖1。龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，與其他組分完全分離。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 線性關(guān)系考察 取龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，且精密稱定于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成2.0 mg／mL 對照品貯備液。精密吸取龍膽苦苷對照品貯備液加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL的溶液，搖勻。質(zhì)量濃度從低到高分別精密吸取20 μL，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣，以化合物進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=930.39X-127.68（r= 0.999 5），表明龍膽苦苷在 1.25～40 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

另稱取獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，且精密稱定于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成500 μg／mL的對照品貯備液。分別精密吸取獐牙菜苦苷對照品貯備液加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、150、200 μg／mL 的溶液，搖勻。質(zhì)量濃度從低到高分別精密吸取 20 μL，在“2.2”項色譜條件下進(jìn)樣，以化合物進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y= 1 391.1X-121.48（r=0.999 2），表明獐牙菜苦苷在0.25～4 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

另稱取獐芽菜苷標(biāo)準(zhǔn)品1.60 mg，且精密稱定于100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成16 μg／mL的對照品貯備液。精密吸取獐芽菜苷對照品貯備液加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8、16 μg／mL 的溶液，搖勻。質(zhì)量濃度從低到高分別精密吸取20 μL，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣，以化合物進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=1.903 5X-1.322 4（r=0.999 8），表明獐芽菜苷在10～320 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗 取遼寧清原生龍膽粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次且每次20 μL，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷峰面積積分值的RSD 分別為 0.81%、0.52%、0.77%，表明該儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取遼寧清原生龍膽粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下，分別于 0、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣分析并計算其3種成分含有量。結(jié)果龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷的RSD 分別為1.07%、0.68%、1.27%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取遼寧清原生龍膽粉末5 份，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣并計算5 份供試品中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷含有量。測得平均值分別為23.58、1.86、0.49 mg／g，RSD 分 別 為 0.66% 、0.92%、0.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含有量的龍膽樣品粉末 0.5 g，精密稱定，共 9 份，每 3 份加入高、中、低3 個質(zhì)量濃度梯度對照品溶液，其加入對照品量與供試品中量的比例分別為1.5 ∶1、1 ∶1、0.5 ∶1，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下分別進(jìn)樣并計算。得龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷平均加樣回收率分別為100.26%、99.84%、100.17%，RSD 分 別 為1.32% 、1.59% 、1.16% 。

2.6 樣品含有量測定 將不同產(chǎn)地生品和炮制品龍膽樣品溶液，在 “2.2”項色譜條件下測定，并計算，結(jié)果見表1。

3 討論

本實驗建立HPLC 法同時測定龍膽飲片中3種成分的含有量，分別考察了乙腈-水和甲醇-水2種流動相體系。結(jié)果表明乙腈-水溶液作流動相時，3種成分不能很好分離，存在較大雜峰干擾獐芽菜苷，而甲醇-水溶液分離較好，也無雜峰干擾。

實驗中收集了22 個產(chǎn)地的商品生龍膽飲片，因品種和產(chǎn)地有所不同，可能在各樣品之間化學(xué)成分的種類和含有量有一些差異，故本實驗選擇了龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含有量測定并比較［15-18］。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地樣品中3種成分的含有量存在明顯差別，遼寧新賓的龍膽苦苷含有量高達(dá)65.875 mg／g，而西藏拉薩此成分含有量最低，為4.217 mg／g；遼寧新賓的獐牙菜苦苷含有量也高于其他產(chǎn)地，為3.170 mg／g，而寧夏銀川在該成分的含有量則為0.285 mg／g；遼寧清原的獐芽菜苷最高，為 0.484 mg／g，西藏拉薩該成分的含有量最低，為0.069 mg／g。

通過HPLC 法測定不同產(chǎn)地的商品生龍膽和相應(yīng)酒炙飲片中3種成分的含有量，結(jié)果表明，大多數(shù)產(chǎn)地龍膽酒炙后龍膽苦苷含有量增加，但酒炙后獐牙菜苦苷和獐芽菜苷含有量變化不一致，一些產(chǎn)地的飲片經(jīng)過黃酒炮制后含有量上升，還有一些產(chǎn)地含有量下降。推測龍膽酒炙后龍膽苦苷含有量增加的原因可能是經(jīng)炮制后發(fā)生了一系列的化學(xué)變化，使該成分含有量增加，也可能是酒炙促進(jìn)了其溶解；而龍膽酒炙后其他2種成分含有量變化不一的原因尚無法做出科學(xué)解釋。這3種成分酒炙后含有量發(fā)生改變的原因都有待深入研究。

表1 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.1 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）