羅漢果中羅漢果皂苷提取工藝的優化及其止咳祛痰作用

陳 敏，王翠紅

（上海健康醫學院附屬周浦醫院藥劑科，上海 201318）

羅漢果Siraitia grosvenorii是我國特有藥食同源植物，主要分布于廣西、廣東、湖南等省，其果實在我國已有三百多年的應用歷史［1］，《中國藥典》 記載其味甘、涼，歸肺、大腸經，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便的作用，用于治療肺熱燥咳、咽痛失音、腸燥便秘［2］。現代藥理研究表明，羅漢果甜苷具有調節血糖平衡、調節脂肪代謝、抗氧化及提高免疫等多種生物活性［3-5］；羅漢果中主要含有葫蘆烷型三萜皂苷、黃酮苷、多糖等成分，其主要活性成分是葫蘆烷型三萜苷類化合物，稱為羅漢果苷［6-8］，它們因甜度高、熱量低、色澤淺、穩定性好、食用安全，可作為甜味劑全部或部分替代蔗糖而廣泛用于各類食品，在藥食兩用中藥、功能食品、食品添加劑等方面前景廣闊。

本實驗擬選取羅漢果主要有效成分羅漢果皂苷V 含有量作為評價指標，在單因素實驗基礎上采用正交試驗優化羅漢果皂苷提取工藝，并通過小鼠氨水引咳法、小鼠氣管酚紅法測定提取物止咳祛痰作用，為該藥材開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 Varian Cary 100 紫外分光光度計（美國Varian公司）；FA2004 電子天平（上海市安亭電子儀器廠）；ME204E 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-8 數顯恒溫水浴鍋（常州市金壇科興儀器廠）；電熱鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.2 試藥 羅漢果皂苷V 對照品（中國食品藥品檢定研究院，含有量≥98%）。羅漢果購自上海萬仕誠有限公司，經專家鑒定符合2015年版 《中國藥典》 一部項下有關規定。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

1.3 動物 SPF 級 ICR 小鼠，雌雄各半，體質量 18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于清潔級動物房，自由進食與飲水，溫度（25±2）℃，相對濕度 40%～60%，人工照明模擬晝夜變化。本實驗方案遵守動物保護、動物福利和倫理原則及相關規定。

2 方法與結果

2.1 提取液制備 稱取藥材粉末10 g，置于具塞試管中，加水提取，過濾，定容，即得。

2.2 總皂苷含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取羅漢果苷V 對照品5.26 mg，加入 10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，即得（0.526 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取羅漢果提取液10 mL，水飽和正丁醇溶液萃取 3 次，每次 10 mL，水浴揮干，殘渣加甲醇定容至250 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.2.3 檢測波長選擇 精密量取對照品、供試品溶液各0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，水浴揮干甲醇，加入新鮮配制的 5% 香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸 0.8 mL，60 ℃水浴中加熱15 min 后置于冰水中冷卻3 min，再加5 mL 冰醋酸。以第 1 管為空白對照，在 200～600 nm 波長處掃描，發現在477 nm 處對照品、供試品溶液均有最大吸收，故選擇其作為檢測波長。

2.2.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 具塞比色管中，水浴揮干甲醇，加入新鮮配制的5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴中加熱15 min 后置于冰水中冷卻3 min，再加5 mL 冰醋酸，以第 1 管做空白對照，于 477 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A= 0.006 3X-0.131（R2=0.999 4），在 34～105 mg／L 范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密量取對照品溶液 6 份，按“2.2.4”項下方法顯色，測定吸光度，測得其 RSD 為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密量取對照品溶液 6 份，按“2.2.4”項下方法顯色，以空白溶劑為對照，于 0、1、2、4、8、12 h 測定吸光度，測得其 RSD 為 0.3% ，表明該方法穩定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 量取羅漢果皂苷含有量已知的提取液5 份，加入羅漢果皂苷 V 對照品溶液，按 “2.2.4”項下方法顯色，測定吸光度，計算回收率。結果，羅漢果皂苷平均加樣回收率為97.66%，RSD 為0.63%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 浸泡時間 精密稱取15 份樣品粉末于具塞試管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份設置浸泡時間 0、30、60、90、120 min，提取時間 60 min，計算羅漢果皂苷含有量，結果見圖1。由圖可知，羅漢果皂苷含有量隨浸泡時間增加而提高，但超過90 min 后趨勢不明顯，故選擇30、60、90 min 進行正交試驗。

圖1 浸泡時間對羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.2 料液比 精密稱取12 份藥材粉末于試管中，每份10 g，每 3 份設置料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25，浸泡時間 60 min，提取時間 60 min，計算羅漢果皂苷含有量，結果見圖2。由圖可知，羅漢果皂苷含有量在料液比1 ∶5～1 ∶20 時提高，但超過 1 ∶20 后不再增加，故選擇 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20 進行正交試驗。

圖2 料液比對羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.3 提取時間 精密稱取15 份藥材粉末于試管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份設置提取時間 30、60、90、120、150 min，浸泡時間 60 min，計算羅漢果皂苷含有量，結果見圖3。由圖可知，羅漢果皂苷含有量在提取時間30～120 min 時提高，但超過90 min 后趨勢不明顯，故選擇 30、60、90 min 進行正交試驗。

圖3 提取時間對羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.4 提取次數 精密稱取3 份藥材粉末于試管中，每份10 g，加入 15 倍量水，浸泡時間 60 min，提取時間 60 min，過濾，得到第1 次提取后的浸提液和濾渣，重復2 次，將4次浸提液分別編號，計算羅漢果總皂苷含有量，結果見圖4。由圖可知，羅漢果總皂苷含有量隨著提取次數增加而明顯降低，故選擇 1、2、3 次進行正交試驗。

圖4 提取次數對羅漢果皂苷含有量的影響

2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇料液比（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、浸泡時間（D）作為影響因素，羅漢果皂苷V 含有量作為評價指標，L9（34）正交表優化提取工藝。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

由此可知，各因素影響程度依次為料液比＞提取次數＞提取時間＞浸泡時間，其中料液比對羅漢果皂苷V 含有量有顯著影響（P＜0.05），最優工藝為 A2B2C3D2。考慮到浸泡時間的影響程度最低，并結合工業生產實際情況和成本，將最優工藝修正為 A2B2C3D1，即藥材加 15 倍量水浸泡30 min 后提取 3 次，每次 60 min。

2.5 驗證試驗 按 “2.4”項下優化工藝進行3 批驗證試驗，結果見表4，可知該工藝穩定可行。

表4 驗證試驗結果（n=3）

表5 羅漢果提取物對小鼠咳嗽潛伏期、3 min 內咳嗽次數的影響（， n=10）

表5 羅漢果提取物對小鼠咳嗽潛伏期、3 min 內咳嗽次數的影響（， n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 劑量 咳嗽潛伏期／s 3 min 咳嗽次數／次 止咳率／%空白組 20 mL／kg 73.48±23.81 5.18±1.26 —陽性對照組 30 mg／kg 100.47±45.39? 2.05±2.76 65.34羅漢果提取物低劑量組 25 g／kg 92.09±61.29 4.79±6.41 29.37羅漢果提取物高劑量組 50 g／kg 103.62±51.4? 2.87±2.32? 47.32

2.6 止咳祛痰作用測定

2.6.1 小鼠氨水引咳法 40 只小鼠隨機分為空白組（等溶劑蒸餾水）、陽性對照組（復方磷酸可待因）及羅漢果提取物低、高劑量組（25、50 g／kg），每組 10 只，灌胃給藥，給藥體積 0.02 mL／g，1 次／d，連續 5 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥1 h 后，將小鼠放入加有濃氨水的多功能誘咳引喘儀中霧化20 s，記錄咳嗽潛伏期（從噴霧開始至發生咳嗽的時間）、3 min 內咳嗽次數，結果見表5。由表可知，與空白組比較，羅漢果提取物高劑量組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長（P＜0.05），3 min 內咳嗽次數顯著降低（P＜0.05）。

2.6.2 小鼠氣管酚紅法 40 只小鼠隨機分為空白組、氯化銨組（15 mg／kg）及羅漢果提取物低、高劑量組（25、50 g／kg），每組 10 只，灌胃給藥，給藥體積 0.02 mL／g，1 次／d，連續 5 d，末次給藥前禁食不禁水 12 h。末次給藥1 h 后，小鼠腹腔注射 0.5% 酚紅溶液（0.01 mL／g），1 h 后處死，剝離氣管周圍組織，剪下甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，置于含有2 mL 生理鹽水的試管中，加入0.1 mL 5%碳酸氫鈉溶液，離心 30 min，分離上清液，546 nm 波長處測定吸光度，結果見表6。由表可知，與空白組比較，羅漢果提取物組酚紅質量濃度顯著增加（P＜0.05），以高劑量組更明顯。

表6 羅漢果提取物對小鼠氣管酚紅分泌量的影響（，n=10）

表6 羅漢果提取物對小鼠氣管酚紅分泌量的影響（，n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 劑量 酚紅／（mg·L-1）空白組 20 mL／kg 4.23±0.84氯化銨組 15 mg／kg 6.25±2.17羅漢果提取物低劑量組 25 g／kg 6.06±0.95?羅漢果提取物高劑量組 50 g／kg 6.33±1.57?

3 討論

羅漢果皂苷為葫蘆烷型三萜烯葡萄糖苷，極性較大，提取溶劑主要為水、乙醇或兩者混合溶劑，提取方法主要為直接溶劑提取、超聲提取、微波提取［9］。韋文俊等［10］采用正交試驗優化羅漢果甜苷V 提取工藝，發現與50%乙醇回流提取比較，水煎煮法提取后其含有量較高；鄧福禮等［11］采用微波輔助濁點萃取法比較乙醇、甲醇、水、非離子表面活性劑GX-080 和TX-100 對羅漢果皂苷V 提取率的影響，發現該成分在乙醇中溶解度很低，含有量僅為2.8 mg／g，在水中達 12 mg／g，而在 GX-080、TX-100 中更高，分別為 13.07、12.87 mg／g，故綜合考慮經濟成本、操作難易度等因素，本研究選擇水作為溶劑。結果表明，羅漢果中羅漢果皂苷最優提取工藝為加15 倍量水浸泡30 min后提取3 次，每次60 min，該工藝穩定可行，適合工業化生產，并且50 g／kg 提取物具有一定鎮咳祛痰作用。

近年來，羅漢果苷降血糖、降脂、抗氧化、抗炎等多種生理活性被不斷證實，在養生保健方面的研發中顯示出重要地位，目前已有一些產品上市［12-13］，但總體上數量還較少，尚有待進一步探索。