提取-共沸精餾耦合技術提取白術、桂枝揮發油工藝優化

李春花，李佳佳，頓佳穎，郭秋紅，鄭 鵬，張國紅

（1.河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200；2.河北中醫學院科技處，河北 石家莊 050200；3.河北中醫學院基礎醫學院，河北 石家莊 050200）

全國名老中醫邢月朋長期從事心血管疾病診治，根據多年臨床經驗積累，總結出治療氣虛血瘀、陽虛水停型充血性心力衰竭的經驗方——葶藶生脈方，方中的白術、桂枝性味功效不盡相同，配伍使用所治病位既可走表，亦可走里，有通陽化氣、健脾除濕、宣暢上下氣機之功。現代醫學研究表明，白術、桂枝主要有效成分白術內酯Ⅰ、桂皮醛具有抗炎、抗腫瘤、解熱鎮痛、抗菌等多種藥理作用［1-7］。

目前在中藥制劑生產中，揮發油提取大多采用水蒸氣蒸餾法［8］，但用于提取水溶性較強的揮發油時提取效率較低，而提取-共沸精餾耦合技術對該類成分的提取有顯著優勢?？紤]到白術、桂枝揮發油具有一定親水性，本實驗通過提取-共沸精餾耦合技術提取這些成分，采用正交試驗優化該工藝，旨在提高揮發油得率及有效成分含有量，提高制劑工藝水平，保證藥物療效。

1 材料

1.1 儀器 購于美國Waters 公司的Waters e2695 高效液相色譜儀，配置2489 UV／Vis 檢測器；購于美國安捷倫科技公司的安捷倫7890B 氣相色譜儀，配置北京中惠普分析技術研究所的SPH-300 氫氣發生器、SPB-3 全自動空氣源；購于上海精科儀器廠的TG328B 分析天平；購于上海樂祺精密電子廠的LQ-A10002 電子天平；購于杭州法蘭特超聲波有限公司的FRQ-1008HT 超聲波清洗器；購于天津市泰斯特儀器有限公司的98-1-B 型電子調溫電熱套；津隆針筒微孔濾膜，孔徑 0.45 μm（有機系）。

1.2 材料

1.2.1 藥材 白術（產地浙江磐安）、桂枝（產地廣西）購于安國藥材市場，經河北中醫學院侯芳潔老師鑒定分別為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝，符合2015版 《中國藥典》 一部相關項下規定。

1.2.2 試藥 購于深圳市中發源生物科技有限公司的分析純無水硫酸鈉；購于天津市永大化學試劑有限公司的分析純無水乙醇；購于天津市大茂化學試劑廠的色譜純乙腈、甲醇。購于上海源葉生物科技有限公司的桂皮醛（批號H02M6Q1，含有量 98%）、白術內酯Ⅰ（批號 ZM0311BC13，含有量98%）。

2 方法與結果

2.1 桂皮醛 GC 分析［9-12］

2.1.1 色譜條件 安捷倫HP-5 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫，初始溫度 90 ℃，保持2 min，以 3 ℃ ／min 速率升至 140 ℃，保持 6 min，再以7 ℃ ／min速率升至 180 ℃，保持5 min；進樣量1 μL，分流進樣，分流比50 ∶1；載氣N2，氫火焰離子化檢測器（FID）；進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度250 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 桂皮醛GC 色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛對照品適量，甲醇溶解后置于 5 mL 量瓶中，定容，即得（質量濃度為2.19 mg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取白術、桂枝適量，加8 倍量水浸泡2 h 后提取4 h，得到揮發油，無水硫酸鈉干燥。無水乙醇溶解1 mL，置于5 mL 量瓶中，定容，即得。

2.1.4 線性關系考察 取 “2.1.2”項下對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，得到方程為Y=64 706X＋1.749 8（r=0.999 5），在2.19～10.95 μg 范圍內呈良好的線性關系。

2.1.5 方法學考察 精密度試驗中，桂皮醛峰面積RSD（n=6）為1.45%，表明儀器精密度良好；穩定性試驗中，0、2、4、6、8、10 h 桂皮醛峰面積 RSD（n= 6）為0.80%，表明溶液在10 h 內穩定性良好；重復性試驗中，桂皮醛含有量RSD（n=6）為1.00%，表明該方法重復性良好；加樣回收率試驗中，桂皮醛平均加樣回收率為96.99% ，RSD 為（n=9）1.84% 。

2.2 白術內酯ⅠHPLC 分析［13-15］

2.2.1 色譜條件 YMC J′sphere ODS-H80-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流動相乙腈-水，等度洗脫（60 ∶40）；體積流量 1.0 mL／min；柱溫 30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量 10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 白術內酯ⅠHPLC 色譜圖

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取白術內酯Ⅰ對照品適量，甲醇溶解后置于5 mL 量瓶中，定容，即得（質量濃度為 0.80 mg／mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 同 “2.1.3”項。

2.2.4 線性關系考察 取 “2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，得到方程為Y=970 991X-347 905（r=0.999 7），在1.62～8.03 μg 范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 方法學考察 精密度試驗中，白術內酯Ⅰ峰面積RSD（n=6）為 1.63%，表明儀器精密度良好；穩定性試驗中，0、2、4、6、8、10 h 白術內酯Ⅰ峰面積 RSD（n=6）為1.38%，表明溶液在 10 h 內穩定性良好；重復性試驗中，白術內酯Ⅰ含有量 RSD（n=6）為1.74%，表明該方法重復性良好；加樣回收率試驗中，白術內酯Ⅰ平均加樣回收率為97.89%，RSD（n=9）為 1.63%。

2.3 提取工藝優化 選擇浸泡時間（A，2、3、4 h）、提取時間（B，2、4、6 h）、加水量（C，8、10、12 倍）作為影響因素，揮發油提取率及桂皮醛、白術內酯Ⅰ總量的綜合評分作為評價指標，采用L9（34）正交表安排試驗，結果見表1～2。由表可知，各因素對提取工藝影響程度依次為 A＞B＞C，浸泡時間（A）有顯著影響（P＜0.05），最佳水平組合為 A3B3C2，即浸泡時間3 h，提取時間 6 h，加水量10 倍。

表1 試驗設計及結果

表2 方差分析

2.4 驗證試驗 按 “2.3”項下優化工藝進行3 批驗證試驗，結果見表3，可知該方法合理可行。

表3 驗證試驗結果（n=3）

3 討論

目前，揮發油提取大多采用 《中國藥典》 四部收錄的水蒸氣蒸餾法，該方法簡便易行，但在提取過程中只經歷了1 次氣液傳質和平衡過程，對含油量較低、水溶性較強的揮發油提取效率較低［16］。提取-共沸精餾耦合技術包含1個精餾塔，在揮發油富集過程中揮發性成分隨水蒸氣進入精餾塔，塔中填料使氣、液兩相逆流多級接觸，完成多次氣-液傳質過程，從而提高了揮發油的提取率［17］。

白術揮發油的提取率與粒度有關［18-20］，本研究針對該因素進行預實驗篩選。將白術粒度分為塊狀、最粗粉、細粉3種規格，發現最粗粉提取的揮發油含有量明顯高于其他2種規格，而塊狀最低，其原因為塊狀白術中揮發油不易提出，如果提盡則耗工耗時；細粉在粉碎過程中揮發油可能會損失，同時在提取過程中易粘連于壁上，給操作造成不便。因此，確定將白術粉碎為最粗粉。

在 《中國藥典》 一部中，采用HPLC 法測定桂皮醛含有量，但該方法上樣量較大，對于本身含有量較低的揮發性成分并不適用。由于桂皮醛易揮發，故本實驗采用GC法分析，該方法試樣量少，并且檢測靈敏，速度快，分離選擇性好。升溫速率與分流比對樣品分離有重要影響，升溫速率較大，分流比較小，將導致成分分離不徹底，分離度達不到要求；反之，則會造成分離時間較長，故本實驗采用先慢后快的方式進行升溫，在第一階段以3 ℃／min 速率升溫，使桂皮醛與其他成分有效分離；第二階段以7 ℃／min速率升溫，以盡快達到所需溫度，并節省分析時間。

白術揮發油的主要成分為蒼術酮，但其性質并不穩定，長時間加熱與光照時會發生氧化分解，轉化為白術內酯類成分，故本實驗選擇白術內酯Ⅰ作為評價指標。白術內酯Ⅰ是酯類成分，沸點較高，不宜采用GC 法測定，故本實驗通過HPLC 法測定其含有量，同時由于該成分極性較小，故流動相中乙腈所占比例較大，最終確定流動相為乙腈-水（60 ∶40）。

致謝：本研究受到河北省科技計劃項目基金資助，同時感謝科研中心張闖老師的幫助。